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Proofreading

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Synthesis of new DNA molecules is carried out by the enzyme DNA polymerase, which adds nucleotides on the daughter strand complementary to the template DNA strand. DNA polymerase has a higher affinity to add the correct base and ensures fidelity during DNA replication. Furthermore,  it exhibits proofreading activity during replication, using an exonuclease domain that cuts off incorrect nucleotides from the nascent DNA strand.
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Translesion DNA Polymerases02:10

Translesion DNA Polymerases

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Translesion (TLS) polymerases rescue stalled DNA polymerases at sites of damaged bases by replacing the replicative polymerase and installing a nucleotide across the damaged site. Doing so, TLS allows additional time for the cell to repair the damage before resuming regular DNA replication.
TLS polymerases are found in all three domains of life - archaea, bacteria, and eukaryotes. Of the different classes of TLS polymerases, members of the Y family are fitted with specialized structures that...
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PCR

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The Replisome03:01

The Replisome

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DNA replication is carried out by a large complex of proteins that act in a coordinated matter to achieve high-fidelity DNA replication. Together this complex is known as the DNA replication machinery or the replisome.
The synthesis of the leading and lagging strands is a highly coordinated process. To explain this, the “Trombone model” was proposed by Bruce Alberts in 1980. The DNA loop formation starts when a primer is synthesized on the parent lagging strand. The loop grows with...
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Lagging Strand Synthesis01:59

Lagging Strand Synthesis

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During replication, the complementary strands in double-stranded DNA are synthesized at different rates. Replication first begins on the leading strand. Replication starts later, occurs more slowly, and proceeds discontinuously on the lagging strand.
There are several major differences between synthesis of the leading strand and synthesis of the lagging strand. 1) Leading strand synthesis happens in the direction of replication fork opening, whereas lagging strand synthesis happens in the...
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Variantes de ADN polimerasa con alta procesividad y precisión para codificar y decodificar secuencias de ácido

Hidekazu Hoshino1,2, Yuuya Kasahara1,2, Masayasu Kuwahara3

  • 1National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition, 7-6-8 Saito-Asagi, Ibaraki, Osaka 567-0085, Japan.

Journal of the American Chemical Society
|December 11, 2020
PubMed
Resumen

Los investigadores diseñaron variantes de la ADN polimerasa KOD para sintetizar y transcribir eficientemente los ácidos nucleicos bloqueados (LNA), una molécula terapéutica prometedora. Estas polimerasas diseñadas permiten la creación de nuevos aptámeres y catalizadores de LNA, avanzando en la terapéutica del ácido nucleico.

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Área de la Ciencia:

  • La bioquímica
  • Biología molecular
  • Biotecnología

Sus antecedentes:

  • Los ácidos nucleicos xenobióticos (XNA) son análogos químicamente modificados del ADN y el ARN con potencial terapéutico.
  • El ácido nucleico bloqueado (LNA) es un XNA prometedor, pero su desarrollo terapéutico se ve obstaculizado por la falta de herramientas eficientes de síntesis y transcripción inversa.
  • Los métodos existentes para el desarrollo de aptamer y catalizador de LNA requieren polimerasas especializadas para la síntesis de ADN a LNA y la transcripción inversa de LNA a ADN.

Objetivo del estudio:

  • Desarrollar polimerasas de ADN diseñadas capaces de una síntesis (codificación) de LNA eficiente y una transcripción inversa (decodificación).
  • Mejorar el rendimiento de la ADN polimerasa KOD para crear terapias basadas en LNA.
  • Para permitir la síntesis de secuencias largas de LNA y acomodar modificaciones terapéuticas comunes como el 2'-O-metilo (2'-OMe).

Principales métodos:

  • Análisis estructural de la ADN polimerasa KOD para guiar la ingeniería de proteínas.
  • Mutagénesis dirigida al sitio para crear variantes de codificación y decodificación de LNA de la ADN polimerasa KOD.
  • Validación experimental de la eficiencia, la precisión y la aceptación del sustrato de las polimerasas diseñadas, incluida la síntesis de LNA de kilobase y SELEX para aptameros de LNA.

Principales resultados:

  • Se diseñaron con éxito dos variantes de la ADN polimerasa KOD, KOD DGLNK (ADN → LNA) y KOD DLK (LNA → ADN).
  • Ambas variantes demostraron una eficiencia y precisión significativamente mejoradas en la síntesis de LNA y la transcripción inversa.
  • Los LNA de longitud kilobásica se sintetizaron utilizando KOD DGLNK, y las variantes aceptaron modificaciones 2'-O-metilo, cruciales para aplicaciones terapéuticas.

Conclusiones:

  • Las variantes de ADN polimerasa KOD diseñadas proporcionan herramientas poderosas para la síntesis de LNA y la transcripción inversa.
  • Estas variantes superan las limitaciones anteriores, facilitando el desarrollo de nuevos aptámeres y catalizadores de LNA.
  • La tecnología desarrollada avanza en el campo de la terapéutica XNA al permitir la creación de moléculas distintas del ADN y el ARN naturales.