Aceleración de la ingeniería de aptamer post-SELEX utilizando la digestión de la exonucleasa

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Biología molecular
• Química analítica

Sus antecedentes:

• La Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX) se utiliza para aislar aptameros, pero la identificación de secuencias óptimas con alta afinidad y especificidad es un desafío.
• Los métodos de ingeniería de aptamer post-SELEX existentes a menudo tienen limitaciones, que incluyen sesgo, tasas de éxito variables y la necesidad de equipos especializados.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un ensayo generalizable, rápido y libre de etiquetas para interrogar las propiedades de unión de los aptameros.
• Diseñar aptameros con características de unión mejoradas, mejorando específicamente la afinidad y la especificidad de las moléculas objetivo.
• Demostrar la aplicabilidad del método desarrollado tanto para los aptameros de pequeñas moléculas como para los que se unen a proteínas.

Principales métodos:

• Se utilizó la exonucleasa III y la exonucleasa I para analizar las propiedades de unión de los aptameros mediante el monitoreo de los cambios en la cinética de la digestión tras la unión del ligando.
• Se aplicó el ensayo a un aptamer de ADN que se une a la ocratoxina y sus mutantes para correlacionar la unión del ligando con la cinética de la digestión de la exonucleasa.
• Diseñó un aptamer de ADN con unión indiscriminada a ATP, ADP, AMP y adenosina mediante la detección de mutantes e identificación de aptamers específicos de adenosina de alta afinidad.

Principales resultados:

• La unión de ligandos alteró la cinética de la digestión de la exonucleasa de una manera que se correlacionó estrechamente con la afinidad aptamer-ligando.
• Identificó dos aptameros de alta afinidad que se unen específicamente a la adenosina de una biblioteca de mutantes.
• Desarrolló un sensor basado en aptamer electroquímico utilizando los aptamers de ingeniería, logrando un límite de detección de 1 μM para la adenosina en el suero al 50%.

Conclusiones:

• El ensayo basado en exonucleasa desarrollado es un método generalizable y eficaz para caracterizar las afinidades de unión aptamer-ligando.
• Este enfoque facilita la ingeniería de aptameros con propiedades de unión mejoradas, adecuadas para diversas aplicaciones, incluida la biosensorización.
• El método es adaptable para el cribado de alto rendimiento y se puede aplicar a aptámeres de ADN de diversas secuencias, estructuras y longitudes.