Dinámica del potencial de la membrana mitocondrial reversible con un reportero de voltaje de rodamina enmascarado

Área de la Ciencia:

• Biofísica de las células
• Fisiología mitocondrial
• Desarrollo de la sonda fluorescente

Sus antecedentes:

• Las mitocondrias generan ATP a través de la fosforilación oxidativa, impulsada por el potencial de la membrana mitocondrial interna (ΔΨm).
• La medición precisa de ΔΨm en células intactas es un desafío con los métodos tradicionales.
• Las sondas fluorescentes existentes para ΔΨm a menudo sufren de artefactos y requieren piscinas de colorantes externos.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un nuevo reporter fluorescente para el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) que supere las limitaciones de los métodos actuales.
• Para crear una sonda que se localiza en las mitocondrias y informa la dinámica ΔΨm sin artefactos dependientes de la acumulación.
• Para permitir el monitoreo simultáneo en tiempo real de ΔΨm con otros parámetros celulares.

Principales métodos:

• Modificación de un indicador basado en la transferencia de electrones fotoinducida (PeT) (RhoVR) mediante el enmascaramiento de su carboxilato como un éster acetoximetilo (AM) para la orientación mitocondrial.
• Utilizando esterasas intracelulares para dividir el éster AM, atrapando la sonda dentro de la matriz mitocondrial.
• Prueba de la localización, reversibilidad y respuesta de la sonda a los desacopladores (FCCP) en varias líneas celulares utilizando imágenes multicolores.

Principales resultados:

• La sonda desarrollada, SPIRIT RhoVR (Molécula pequeña, permeable, redistribuida internamente para el reportero de voltaje de rodamina dirigido a la membrana interna), se localizó con éxito en las mitocondrias en múltiples tipos de células.
• SPIRIT RhoVR demostró respuestas reversibles a los cambios de ΔΨm inducidos por FCCP en concentraciones muy bajas, sin necesidad de colorante exógeno.
• La sonda demostró ser compatible con imágenes multicolores, lo que permite el monitoreo simultáneo del Ca2+ citosólico, el potencial de la membrana plasmática y ΔΨm.

Conclusiones:

• SPIRIT RhoVR representa el primer reporter fluorescente ΔΨm que funciona independientemente de la acumulación de colorante dependiente de ΔΨm.
• Esta nueva sonda ofrece un método robusto y libre de artefactos para la evaluación en tiempo real del potencial de la membrana mitocondrial en las células vivas.
• SPIRIT RhoVR facilita el análisis celular multiparamétrico avanzado, abriendo nuevas vías para estudiar la función mitocondrial y la energética celular.