Ligado ortogonal de proteínas controlado por pH utilizando ligasas de péptidos de asparaginyl

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Ingeniería de proteínas
• Biología Química

Sus antecedentes:

• Las ligasas peptídicas asparaginyl (PAL) son conocidas por su ligadura eficiente a los residuos de asparaginyl (Asn).
• Los PAL normalmente requieren un pH neutro para la ligadura de Asn y un pH ácido para la ligadura de aspartilo (Asp), lo que limita la eficiencia de la ligadura específica de Asp.
• El uso de PAL para la ligadura específica de Asp ha sido poco explorado debido a las ineficiencias percibidas en el pH ácido.

Objetivo del estudio:

• Investigar y optimizar el uso de enzimas PAL para la ligadura eficiente de péptidos específicos de Asp.
• Desarrollar una estrategia de ligadura ortogonal controlada por pH utilizando PAL para el etiquetado secuencial.
• Demostrar la aplicación de este método en la creación de proteínas biológicas de doble etiqueta.

Principales métodos:

• Actividad catalítica evaluada de las enzimas PAL, incluida VyPAL2, hacia sustratos P1-Asp a pH ácido (4-5).
• Se comparó la actividad de las PAL con la de la sortasa A para la ligación de Asp.
• Desarrolló y aplicó una estrategia de ligadura secuencial y controlada por pH para el doble etiquetado de proteínas (sfGFP y affibody).

Principales resultados:

• Las enzimas PAL exhiben una actividad catalítica significativamente mayor hacia los sustratos P1-Asp a pH 4-5 en comparación con la sortasa A.
• Se lograron ligaduras intra e intermoleculares eficientes en las uniones de Asp utilizando PAL en condiciones ácidas.
• Se ha realizado con éxito el etiquetado secuencial N-C y C-N de proteínas con cargas útiles distintas (péptidos, fármacos, colorantes).

Conclusiones:

• Las enzimas PAL demuestran utilidad práctica para la ligadura específica de Asp a pH ácido, superando las limitaciones anteriores.
• La ligadura ortogonal controlada por pH utilizando PAL permite una modificación secuencial precisa de las proteínas.
• Esta metodología facilita la preparación de proteínas biológicas sofisticadas y multifuncionales para aplicaciones farmacológicas.