Bases estructurales para la vigilancia de las discrepancias mediante CRISPR-Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• La bioquímica

Sus antecedentes:

• La edición del genoma CRISPR-Cas9 es una herramienta poderosa, pero sufre de escisión del ADN fuera del objetivo debido a la mala comprensión de los mecanismos de reconocimiento de desajustes.
• Las variantes existentes de Cas9 con una mejor discriminación de desajuste a menudo exhiben tasas reducidas de escisión en el objetivo, lo que limita su potencial terapéutico.

Objetivo del estudio:

• Aclarar los mecanismos estructurales subyacentes al reconocimiento y la escisión del desajuste de Cas9.
• Para diseñar la próxima generación de variantes de alta fidelidad Cas9 con mayor especificidad y actividad retenida.

Principales métodos:

• Se empleó microscopía crioelectrónica guiada por cinética (cryo-EM) para capturar las estructuras de Cas9 en varias etapas de la escisión del desajuste del ADN.
• Se utilizó la mutagénesis dirigida al sitio para alterar los residuos específicos involucrados en la estabilización del desajuste.

Principales resultados:

• Se observó una conformación dúplex guía lineal distinta de ARN-ADN, que inhibe la activación de Cas9, en presencia de desajustes.
• Los desajustes distales al motivo adyacente del protospacer son estabilizados por un bucle de dominio RuvC reorganizado.
• La mutagenesis de los residuos estabilizadores de desajuste redujo con éxito la escisión fuera del objetivo mientras se conservaba la escisión rápida en el objetivo.

Conclusiones:

• Dirigirse a las regiones Cas9 involucradas en la tolerancia al desajuste ofrece una estrategia viable para desarrollar herramientas de edición de genoma de alta fidelidad.
• Esta investigación proporciona una base estructural para el diseño de sistemas CRISPR-Cas9 mejorados con mayor especificidad para aplicaciones terapéuticas.