Orientación bioortogonal y fluorogénica de los fluoróforos sensibles al voltaje para visualizar la dinámica del...

Área de la Ciencia:

• Electrofisiología celular
• Biología orgánica
• Desarrollo de sondas fluorescentes

Sus antecedentes:

• Los potenciales de transmembrana a través de bicapas de orgánulos, como el retículo endoplasmático (ER), son cruciales para las funciones celulares, pero difíciles de medir.
• Los métodos tradicionales de electrofisiología como el patch-clamping no son adecuados para el estudio de las membranas de las orgánulas intracelulares.
• Existe la necesidad de herramientas ópticas precisas para monitorear los cambios dinámicos en el potencial de la membrana orgánica dentro de las células vivas.

Objetivo del estudio:

• Diseñar, sintetizar y validar un nuevo reporter de tensión fluorescente, LUnAR RhoVR, para el monitoreo del potencial de la membrana ER en las células vivas.
• Para demostrar la capacidad de la sonda para apuntar a la ER y proporcionar señales de fluorescencia sensibles al voltaje.
• Aplicar la sonda para investigar la señalización del calcio ER y el acoplamiento funcional de la membrana plasmática con ER.

Principales métodos:

• Diseño y síntesis de Ligation Unquenched for Activation and Redistribution RhoVR (LUnAR RhoVR), un reportero de voltaje basado en la rodamina.
• Conjugación de un transciclocteno (TCO) con una ceramida (Cer-TCO) para la orientación específica de ER.
• Aplicación simultánea de LUnAR RhoVR y Cer-TCO en células vivas, utilizando el apagado de tetrazina y la química de clic de TCO-tetrazina para la fluorescencia dirigida.
• Técnicas de imagen óptica, incluidas las imágenes de tensión localizadas en ER de dos colores y las imágenes citosólicas de Ca2+.

Principales resultados:

• Síntesis y validación exitosas de LUnAR RhoVR como una sonda sensible al voltaje específicamente dirigida al ER a través de Cer-TCO.
• Demostración de fluorescencia mínima fuera del objetivo debido al requisito de coincidencia de la sonda y el TCO en el ER.
• Validación de la electroneutralidad de la liberación de Ca2+ de las reservas internas mediante tensión acoplada y obtención de imágenes de Ca2+.
• Visualización directa del acoplamiento funcional entre las membranas plasmáticas y ER, proporcionando evidencia de la respuesta potencial de ER a los cambios de potencial de membrana plasmática.

Conclusiones:

• LUnAR RhoVR es una herramienta robusta para monitorear ópticamente el potencial de la membrana ER en células vivas.
• La sonda facilita el estudio de la dinámica del calcio ER y la interferencia entre la membrana plasmática y la ER.
• Esta tecnología es prometedora para aplicaciones más amplias en la exploración de la fisiología de los orgánulos utilizando sondas conjugadas con TCO.