Bases estructurales para la actividad fuera del objetivo de Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• La bioquímica

Sus antecedentes:

• La nucleasa Cas9 asociada a CRISPR es una poderosa herramienta de edición del genoma.
• La especificidad de Cas9 se basa en la complementariedad del ARN guía con el ADN objetivo.
• La escisión fuera del objetivo por Cas9 plantea riesgos de seguridad para aplicaciones clínicas.

Objetivo del estudio:

• Para aclarar la base estructural de la unión y la escisión fuera del objetivo de Cas9.
• Para entender cómo Cas9 acomoda los desajustes y las deleciones en el ADN objetivo.
• Informar el diseño racional de sistemas de edición de genoma más seguros basados en Cas9.

Principales métodos:

• Cristalografía de rayos X de los complejos de ADN Cas9.
• Análisis de sustratos fuera del objetivo con complementariedad variable.
• Comparación estructural de los modos de unión en el objetivo y fuera del objetivo.

Principales resultados:

• Cas9 se une al ADN fuera del objetivo a través de interacciones de emparejamiento de bases no canónicas.
• Las deleciones de un solo nucleótido se acomodan con saltos de bases o múltiples pares no canónicos.
• Los desajustes PAM-distales inducen desparejamiento dúplex y cambios conformacionales en Cas9.

Conclusiones:

• Las ideas estructurales explican la actividad fuera del objetivo de Cas9.
• Los hallazgos facilitan un diseño mejorado de ARN guía para una mayor especificidad.
• Este trabajo ayuda a desarrollar mejores algoritmos de predicción fuera del objetivo para la tecnología CRISPR.