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Updated: Jul 8, 2025
Identification of Small Molecule-binding Proteins in a Native Cellular Environment by Live-cell Photoaffinity Labeling
Published on: September 20, 2016
Cuantificación de la unión de pequeñas moléculas a proteínas nativas sobreexpresadas en células vivas
Yuwen Yin1, Serena Li Zhao1, Digamber Rane1
1Division of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, College of Pharmacy, The Ohio State University, 500 W. 12th Ave., Columbus, Ohio 43210, United States.
Desarrollamos un nuevo ensayo para medir la fuerza con que los medicamentos se unen a las proteínas nativas dentro de las células vivas. Este ensayo de unión celular con sonda fluorescente (FPCBA) ayuda a cuantificar las interacciones fármaco-objetivo para el descubrimiento de fármacos.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica
- Biología celular
- Farmacología
Sus antecedentes:
- El descubrimiento de fármacos se basa en la comprensión de la afinidad y la selectividad de las moléculas pequeñas para los objetivos de las proteínas.
- La medición precisa de estas interacciones en un contexto celular es crucial para el desarrollo terapéutico.
Objetivo del estudio:
- Desarrollar y validar un nuevo ensayo para cuantificar la unión de moléculas pequeñas a proteínas nativas no etiquetadas dentro de las células vivas.
- Permitir la determinación de las constantes de disociación celular (Kd) y de las constantes de unión competitivas (Ki) de los fármacos candidatos.
Principales métodos:
- Se desarrolló un ensayo de unión celular con sonda fluorescente (FPCBA) utilizando ligandos ligados al fluoróforo.
- Un vector de entrada ribosómica interna (IRES) facilitó la expresión simultánea de la proteína diana y una proteína fluorescente ortogonal (mVenus).
- Se utilizó citometría de flujo para correlacionar la absorción de la sonda con la expresión de proteínas, lo que permitió la medición de Kd.
Principales resultados:
- El FPCBA fue validado utilizando isoenzimas de proteína quinasa C (PKC) y ligandos conocidos como el forbol, el PDBu y la briostatina 1.
- Se determinaron los valores celulares de Kd y Ki para las interacciones con los PKC de longitud completa expresados en células HEK293T.
- La selectividad celular observada para algunos pares de moléculas pequeñas de PKC difiere de los valores bioquímicos conocidos, destacando la importancia del contexto celular.
Conclusiones:
- El FPCBA proporciona un método robusto para medir las afinidades de unión de moléculas pequeñas a proteínas nativas en su entorno celular.
- Este ensayo facilita la cuantificación de las interacciones fármaco-objetivo, ayudando a la optimización de los fármacos candidatos.
- Los hallazgos subrayan la importancia del contexto celular para determinar la selectividad y la eficacia del fármaco.
