Etiquetado de proximidad basado en tirosinasa en células vivas e in vivo

Área de la Ciencia:

• Proteomía
• Biología molecular y celular
• La bioquímica

Sus antecedentes:

• La comprensión de los constituyentes de las proteínas de los orgánulos y los vecinos de las proteínas es crucial para dilucidar la función de los orgánulos y las redes de proteínas.
• El etiquetado de proximidad (PL) es una técnica poderosa para la proteómica espacial, pero las enzimas existentes como APEX, BioID y TurboID tienen limitaciones que incluyen citotoxicidad, cinética lenta y alto fondo.
• Se necesitan enzimas PL mejoradas con mejor biocompatibilidad, velocidad y especificidad para aplicaciones in vivo.

Objetivo del estudio:

• Introducir y caracterizar una nueva tirosinasa bacteriana (BmTyr) como una enzima de etiquetado de proximidad.
• Demostrar la utilidad de BmTyr para el etiquetado de proteínas sin H2O2, rápido y de bajo fondo en células vivas.
• Desarrollar una estrategia para el PL in vivo utilizando BmTyr atado al ligando y aplicarlo al estudio de los proteomas receptores de neurotransmisores.

Principales métodos:

• Codificación genética de la tirosinasa bacteriana (BmTyr) para el etiquetado de proximidad.
• Aplicación de BmTyr para la resolución subcelular de PL y la proteómica en células vivas.
• Diseño de una estrategia de BmTyr atado al ligando para PL in vivo en un modelo de cerebro de ratón vivo.

Principales resultados:

• BmTyr funciona como una enzima PL eficiente, permitiendo el etiquetado libre de H2O2 en 10 minutos en las células vivas.
• BmTyr exhibe una cinética de etiquetado rápida y una baja biotinilación de fondo en comparación con los métodos existentes.
• BmTyr atado a ligandos identificó con éxito el proteoma circundante de los receptores de neurotransmisores (Grm1 y Drd2) en las sinapsis cerebrales del ratón.

Conclusiones:

• La tirosinasa bacteriana (BmTyr) es una enzima novedosa y versátil para el etiquetado de proximidad, que ofrece ventajas sobre las herramientas PL actuales.
• BmTyr facilita una proteómica espacial rápida, específica y biocompatible tanto en contextos celulares como in vivo.
• Este trabajo amplía el conjunto de herramientas para el etiquetado de proximidad y promete mejorar los descubrimientos en la función de los orgánulos y las redes de interacción de proteínas.