El rápido desenrollamiento del ADN acelera la edición del genoma mediante la ingeniería CRISPR-Cas9

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• Biotecnología
• La genética

Sus antecedentes:

• Las enzimas termostables asociadas a CRISPR (Cas9) ofrecen potencial para una mejor edición del genoma debido a una mayor estabilidad de la proteína.
• La enzima Geobacillus stearothermophilus Cas9 (GeoCas9) mostró una actividad limitada en las células humanas, lo que dificulta su aplicación.
• Las mutaciones en el dominio de cuña (WED) son clave para superar las limitaciones en los ortólogos Cas9.

Objetivo del estudio:

• Investigar el mecanismo detrás de la actividad de edición del genoma mejorada de las variantes GeoCas9 desarrolladas en laboratorio.
• Aclarar el papel estructural y funcional del dominio WED en la actividad de GeoCas9.
• Establecer una estrategia general para mejorar otros ortólogos de Cas9 para la edición del genoma.

Principales métodos:

• Evolución de laboratorio de GeoCas9 para mejorar su actividad en células humanas.
• Microscopía cryoelectrónica (cryo-EM) para determinar las estructuras del tipo salvaje y mejorado GeoCas9 (iGeoCas9).
• Ensayos bioquímicos para analizar la cinética de desenrollo del ADN y la captura del sustrato en diferentes condiciones de magnesio.

Principales resultados:

• GeoCas9 (iGeoCas9) desarrollado en laboratorio exhibió niveles de edición de genoma más de 100 veces más altos en comparación con la enzima de tipo salvaje.
• Las estructuras cryo-EM revelaron contactos extendidos entre el dominio iGeoCas9 WED y sustratos de ADN.
• iGeoCas9 demostró una aceleración del desenrollo del ADN, facilitando la captura del sustrato en condiciones de células de mamíferos con restricción de magnesio.

Conclusiones:

• El dominio Cas9 WED juega un papel crucial en el desenrollamiento del ADN, que es esencial para la edición eficiente del genoma.
• El desenrollo acelerado del ADN objetivo es un factor clave para mejorar drásticamente la actividad de edición del genoma inducida por Cas9.
• Este estudio proporciona una estrategia generalizable para la ingeniería de otros ortólogos Cas9 para mejorar sus capacidades de edición del genoma.