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Updated: Jun 22, 2025
Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST
Published on: November 2, 2018
Determinación rápida de la afinidad proteína-ligando por RMN hiperpolarizado fotoinducido
Matthias Bütikofer1, Gabriela R Stadler1, Harindranath Kadavath1
1Institute for Molecular Physical Science, Vladimir Prelog Weg 2, 8093 Zürich, Switzerland.
Desarrollamos un método rápido utilizando la RMN de polarización nuclear dinámica inducida fotoquímicamente (foto-CIDNP) para determinar las afinidades de unión proteína-ligando en minutos. Esta técnica acelera significativamente el descubrimiento de fármacos en etapas tempranas al proporcionar mediciones precisas de afinidad e información de epitopo vinculante.
Área de la Ciencia:
- La bioquímica
- Biología estructural
- Química medicinal
Sus antecedentes:
- La determinación de la afinidad de unión proteína-ligando es crucial para el diseño de fármacos.
- Los métodos actuales a menudo consumen mucho tiempo y son costosos.
- Se necesitan nuevas técnicas de detección rápida para acelerar el descubrimiento de fármacos.
Objetivo del estudio:
- Presentar un nuevo método rápido para determinar las afinidades de unión proteína-ligando.
- Establecer un marco metodológico para las mediciones de afinidad mediante RMN foto-CIDNP.
- Demostrar la precisión y aplicabilidad del método para el descubrimiento de fármacos.
Principales métodos:
- Utilizando la RMN de polarización nuclear dinámica inducida fotoquímicamente (CIDNP por sus siglas en inglés).
- Medición de las afinidades de unión de los péptidos a un dominio PDZ y de los fragmentos ligandos a PIN1.
- Utilizando experimentos de vinculación de la competencia para los ligandos no foto-polarizables del CIDNP.
- Correlación entre el cribado de fragmentos de RMN por foto-CIDNP y la RMN por diferencia de transferencia de saturación (DST).
Principales resultados:
- Se determinaron las afinidades de unión proteína-ligando en 5 a 15 minutos utilizando sólo 0,1 mg de proteína.
- Se validó la precisión del método para las interacciones de dominio péptido-PDZ y fragmento-PIN1.
- Aplicación demostrada con éxito en ensayos vinculantes de competencia.
- Se mostró una fuerte correlación entre la foto-CIDNP y la RMN de ETS para el cribado de fragmentos.
Conclusiones:
- El método de RMN foto-CIDNP proporciona un enfoque rápido y preciso para medir las afinidades proteína-ligando en el rango de micro a millimolar.
- Esta técnica reduce significativamente el tiempo experimental y los requerimientos de proteínas en comparación con los métodos tradicionales.
- El método ofrece información sobre los epítopos de unión en un solo escaneo, mejorando el descubrimiento de fármacos en etapas tempranas.
