Secuenciación directa basada en espectrometría de masas de ARNt de Novo y mapeo cuantitativo de múltiples...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• La genómica

Sus antecedentes:

• La secuenciación de próxima generación (NGS) de ARN es ampliamente utilizada, pero tiene dificultades con la secuenciación directa simultánea y el mapeo cuantitativo de múltiples modificaciones de nucleótidos de ARN.
• La secuenciación basada en espectrometría de masas (MS) ofrece secuenciación directa de todas las modificaciones de ARN, pero normalmente requiere una escalera de MS perfecta, que a menudo no está disponible para los ARNt.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un nuevo método para la secuenciación de novo de ARNt celulares de longitud completa con múltiples modificaciones de nucleótidos con precisión de un solo nucleótido.
• Para superar el requisito de una escalera de EM perfecta en la secuenciación de ARN basada en la espectrometría de masas.
• Permitir el mapeo sistemático, cuantitativo y específico del sitio de las modificaciones del ARN y revelar el contenido informativo completo del ARNt.

Principales métodos:

• Desarrolló y describió un enfoque de secuenciación de complementación por escalera de EM (MLC-Seq).
• MLC-Seq elude el requisito de escalera perfecta para la secuenciación de EM.
• El método conserva la diversidad de la secuencia de ARN y la información de modificación, a diferencia de los métodos basados en NGS.

Principales resultados:

• MLC-Seq permite la secuenciación de nuevo de ARNt celulares heterogéneos de longitud completa con múltiples modificaciones de nucleótido con precisión de un solo nucleótido.
• Se revelaron nuevos perfiles de modificación estequiométrica del tRNA y sus cambios tras el tratamiento con la enzima dealquiladora AlkB.
• Análisis cuantitativo demostrado de diversos ARNt y modificaciones en muestras totales de ARNt cuando se combinan con secuencias de referencia.

Conclusiones:

• MLC-Seq proporciona una herramienta poderosa para el mapeo sistemático, cuantitativo y específico del sitio de las modificaciones del ARN.
• El método revela el contenido informativo completo del ARNt, incluyendo la diversidad de secuencias y los perfiles de modificación.
• MLC-Seq avanza en el campo de la secuenciación de ARN al superar las limitaciones anteriores en el análisis de las modificaciones de ARN.