Ingeniería de la vía de reacción de una oxigenasa de hierro no hemo utilizando la reconstrucción de la secuencia...

Área de la Ciencia:

• Biocatálisis y ingeniería enzimática
• Evolución y diseño de las proteínas
• Biología Química

Sus antecedentes:

• Las oxigenasas dependientes del hierro no hemo (FeII) y el α-cetoglutarato (α-KG) son enzimas versátiles que catalizan transformaciones mediadas por radicales.
• El control de las vías de reacción de estas enzimas es crucial para ampliar sus aplicaciones biocatalíticas.
• Los métodos de ingeniería tradicionales como la mutagenesis dirigida al sitio y el baraje de ADN tienen limitaciones para identificar los residuos críticos.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y mostrar una nueva estrategia guiada por la reconstrucción de secuencias ancestrales (ASR) para la ingeniería de vías de reacción de oxigenasa dependientes de FeII/α-KG.
• Identificar los residuos críticos e interacciones que dictan las vías de reacción de las enzimas utilizando información evolutiva.
• Para convertir las enzimas que realizan la hidroxilación bencílica en variantes capaces de reacciones de expansión de anillo oxidativo.

Principales métodos:

• Reconstrucción de la secuencia ancestral (ASR) para identificar los residuos evolutivamente conservados importantes para el control de la vía.
• Mutagénesis dirigida al sitio combinada para evaluar rápidamente el impacto de los residuos identificados.
• Validación mediante mezclado de ADN y simulaciones mecánicas cuánticas/moleculares (QM/MM).

Principales resultados:

• Residuos específicos identificados en el sitio activo y un enlace hidrógeno clave en el sitio activo del sustrato que es crucial para determinar la vía de reacción dominante.
• Ingeniería exitosa de enzimas existentes y ancestrales para cambiar de hidroxilación bencílica a expansión de anillo oxidativo.
• Demostró la eficacia de ASR en la aceleración de la ingeniería de vías enzimáticas mediante el aprovechamiento de ideas evolutivas.

Conclusiones:

• ASR es una herramienta poderosa para identificar los residuos críticos que controlan las vías de reacción de las enzimas.
• Los residuos identificados y el enlace de hidrógeno son determinantes clave para dirigir el resultado catalítico de las oxygenasas FeII/α-KG dependientes.
• Este enfoque guiado por ASR acelera significativamente la ingeniería de biocatalizadores para nuevas transformaciones químicas.