La inhibición sensible al análogo de las histonas desmetilasas revela la función específica del miembro en la síntesis de proteínas ribosómicas | JoVE Visualize

Área de la Ciencia:

Bioquímica y Biología Molecular
Epigenética y regulación genética
Biología Química y Descubrimiento de Medicamentos

Sus antecedentes:

Las desmetilasas de lisina (KDM) son reguladores cruciales de la expresión génica, utilizando hierro y 2-oxoglutarato (2OG).
Los KDM son objetivos farmacológicos importantes para la terapia del cáncer, pero su diversidad funcional requiere sondas químicas precisas.
La comprensión mecanicista limitada de la heterogeneidad de la DMC humana dificulta el desarrollo terapéutico dirigido.

Objetivo del estudio:

Desarrollar mutantes sensibles al análogo de miembros de la subfamilia KDM4 para diseccionar funciones biológicas individuales.
Crear sondas químicas para la inhibición temporal y específica de la actividad de KDM4.
Aclarar el papel de miembros específicos de KDM4, en particular KDM4A, en los procesos celulares y el cáncer.

Principales métodos:

La ingeniería de los mutantes KDM4 mediante la sustitución de la fenilalanina del sitio activo por la alanina, creando variantes sensibles al análogo.
Desarrollo y aplicación de inhibidores competitivos de los cofactores, como la N-oxalil leucina (NOL), dirigidos a los as-mutantes.
Utilizando pro fármacos NOL permeables a las células para inhibir as-KDM en las células humanas y evaluar la metilación de la histona lisina.
Perturbación condicional de las enzimas KDM ortogonales para definir las funciones específicas de los miembros.

Principales resultados:

Se generaron con éxito KDM4 como mutantes con actividad catalítica de tipo salvaje y especificidad de sustrato.
Se ha identificado a la N-oxalil leucina (NOL) como un inhibidor potente y reversible de los KDM4 como mutantes con eficacia submicromolar.
Capacidad demostrada de los prodrogas de NOL para modular la metilación de la histona lisina en células humanas cultivadas.
Se descubrió una función específica de KDM4A en la promoción de la síntesis de proteínas ribosómicas a través de la desmetilación de histonas específicas del locus.

Conclusiones:

Los mutantes KDM4 sensibles al análogo y los inhibidores NOL proporcionan herramientas poderosas para diseccionar la heterogeneidad funcional de KDM.
KDM4A juega un papel crítico en la regulación de la expresión de rRNA, el ensamblaje de ribosomas y la síntesis de proteínas.
Estos hallazgos ofrecen información mecánica sobre la contribución de KDM4A a los cánceres caracterizados por altas tasas de proliferación.