Análisis de Holdup Multiplex para la medición de alto rendimiento de las constantes de afinidad proteína-ligando...

Área de la Ciencia:

• Proteomía
• La bioquímica
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• El modelado preciso de los interactomas de proteínas requiere cuantificar las afinidades proteína-ligando a través del proteoma.
• Los métodos existentes se enfrentan a limitaciones en el rendimiento y el rango dinámico para el perfil de afinidad a gran escala.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar el Holdup Multiplex, un ensayo basado en la espectrometría de masas para el perfil cuantitativo de alto rendimiento de las afinidades proteína-ligando.
• Aplicar el ensayo para estudiar las afinidades de las proteínas humanas 14-3-3 con los fosfoéptidos e investigar la modulación del sitio de unión inducida por ligandos.

Principales métodos:

• Desarrollo del ensayo Holdup Multiplex utilizando la espectrometría de masas (MS) para la cuantificación de la afinidad.
• Perfilar las afinidades de siete isoformas humanas 14-3-3 frente a 1000 fosfopéptidos.
• Validación mediante cristalografía de rayos X y demostración de transferibilidad con un dominio PDZ.

Principales resultados:

• El Holdup Multiplex cuantifica con precisión miles de constantes de afinidad en una sola ejecución con alto rendimiento, rango dinámico y sensibilidad.
• Se identificaron afinidades escalonadas entre las isoformas 14-3-3, con 14-3-3γ como el aglutinante más fuerte y 14-3-3ε/σ como el más débil.
• Descubrió cientos de nuevos sitios de unión 14-3-3 e identificó la modulación de docenas de sitios por Fusicoccin-A, impactando las vías de señalización clave.

Conclusiones:

• El Holdup Multiplex es una herramienta versátil y poderosa para el perfil de afinidad cuantitativa de todo el proteoma.
• El estudio proporciona nuevos conocimientos sobre las interacciones de las proteínas 14-3-3 y su regulación.
• El ensayo es ampliamente aplicable a varias interacciones proteína-ligando cuantificables por espectrometría de masas.