Variantes personalizadas de PAM CRISPR-Cas9 a través de ingeniería escalable y aprendizaje automático

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Biología molecular
• La genómica

Sus antecedentes:

• La tecnología CRISPR-Cas9 permite diversas ediciones del genoma, pero las enzimas generalistas corren el riesgo de ediciones fuera del objetivo.
• La ingeniería y caracterización de proteínas para aplicaciones específicas de edición del genoma requiere mucho tiempo.
• El desarrollo de herramientas de edición del genoma más seguras y eficientes es crucial.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un método escalable para la reprogramación de las enzimas Cas9 utilizando el aprendizaje automático y la ingeniería de proteínas de alto rendimiento.
• Crear editores Cas9 a medida para objetivos genómicos específicos, mejorando la seguridad y la eficacia.
• Identificar las nuevas variantes de Cas9 con requisitos distintos para el motivo adyacente del protospacer (PAM).

Principales métodos:

• La ingeniería de proteínas de alto rendimiento combinada con el aprendizaje automático para derivar editores Cas9 personalizados.
• Utilizó mutagénesis de saturación informada por estructura-función y selecciones bacterianas para generar enzimas SpCas9 diseñadas.
• Entrenó una red neuronal (algoritmo de aprendizaje automático PAM - PAMmla) para predecir la especificidad de PAM basada en la secuencia de aminoácidos.

Principales resultados:

• Generó casi 1,000 enzimas SpCas9 diseñadas y caracterizó sus requisitos de PAM.
• Se identificaron enzimas Cas9 eficaces y específicas que superan a las variantes existentes en las células humanas.
• Se demostró una reducción de las ediciones fuera del objetivo y se permitió la orientación selectiva de alelos utilizando la evolución in silico dirigida.

Conclusiones:

• PAMmla integra el aprendizaje automático y la ingeniería de proteínas para crear un catálogo diverso de enzimas SpCas9 con especificidades únicas de PAM.
• Este enfoque facilita el paso de las variantes generalistas a las personalizadas de Cas9 para una edición del genoma más segura y eficiente.
• El método desarrollado permite el diseño de la enzima Cas9 dirigido por el usuario para aplicaciones terapéuticas precisas.