El etiquetado triple resuelve un estado intermedio de GPCR mediante el uso de FRET de molécula única de tres colores

Área de la Ciencia:

• Biología estructural
• La bioquímica
• Biofísica molecular

Sus antecedentes:

• La correlación de cambios conformacionales individuales en complejos dinámicos de proteínas es difícil debido a la dependencia de datos estructurales promediados.
• La transferencia de energía de resonancia de Förster de una sola molécula (smFRET) es efectiva para monitorear la dinámica conformacional.
• Las mediciones de distancia simultáneas utilizando tres sondas en smFRET pueden correlacionar los movimientos de dominio, pero requieren un etiquetado específico del sitio.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una estrategia de etiquetado triple ortogonal para la fijación específica del sitio de tres sondas.
• Para superar las limitaciones de las funcionalidades de los aminoácidos nativos en el etiquetado de proteínas.
• Permitir el monitoreo de alta resolución y a varias distancias de complejos dinámicos de proteínas.

Principales métodos:

• Estrategia de etiquetado triple ortogonal que combina la expansión del código genético y el etiquetado bioortogonal.
• Utilizó dos aminoácidos no canónicos distintos y una etiqueta SNAP autoetiquetada enzimática.
• Se estableció un sensor de 3 colores en el receptor metabotrópico humano de glutamato 2 (un GPCR).

Principales resultados:

• Se ha demostrado con éxito la fijación específica de tres sondas sin interferir con las funcionalidades nativas.
• Se aplicó el método al neurorreceptor acoplado a proteínas G multidominio dimérico, mGluR2.
• Se identificó un estado intermedio conformacional no caracterizado previamente de mGluR2 utilizando smFRET de 3 colores.

Conclusiones:

• La estrategia de etiquetado triple ortogonal propuesta es eficaz para el etiquetado preciso de proteínas complejas con múltiples sondas.
• Este método supera los desafíos significativos en el etiquetado específico del sitio para estudios avanzados de smFRET.
• Los hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre la dinámica conformacional de los GPCR, ejemplificada por mGluR2.