Un replicoma T7 ortogonal para la hipermutación continua y la evolución acelerada en E. Coli

Área de la Ciencia:

• Biología sintética
• Biología molecular
• Ingeniería de proteínas

Sus antecedentes:

• Acelerar la evolución de las proteínas es crucial para desarrollar nuevas funciones.
• Los métodos existentes para la evolución dirigida se enfrentan a limitaciones de velocidad y eficiencia.
• Mantener la integridad del genoma del huésped durante la hipermutación es un desafío clave.

Objetivo del estudio:

• Diseñar un sistema de replicación de ADN ortogonal para la hipermutación genética controlada en Escherichia coli.
• Mejorar las funciones de las proteínas a través de una evolución acelerada.
• Para demostrar la utilidad del sistema en la mejora rápida de la actividad enzimática.

Principales métodos:

• Se construyó un sistema de replicación de ADN ortogonal (T7-ORACLE) en Escherichia coli utilizando componentes del replicoma T7 de los bacteriófagos.
• Variantes de polimerasa de ADN T7 diseñadas para lograr tasas de mutación significativamente elevadas in vivo.
• Utilizó plásmidos circulares para una alta eficiencia de transformación e integración en flujos de trabajo estándar de biología molecular.

Principales resultados:

• Se lograron tasas de mutación in vivo de 1,7 × 10^-5 sustituciones por base, ~ 100,000 veces más altas que la tasa de mutación genómica.
• Se ha demostrado la evolución continua de la β-lactamasa TEM-1, aumentando su actividad 5000 veces frente a antibióticos específicos en una semana.
• El sistema mantuvo la integridad del genoma del huésped durante la hipermutación.

Conclusiones:

• El sistema T7-ORACLE proporciona una poderosa plataforma para la evolución rápida y dirigida de las proteínas.
• Este enfoque acelera significativamente el descubrimiento y la optimización de las funciones de las proteínas.
• El sistema tiene amplias aplicaciones en ingeniería de proteínas y biología sintética.