Plataforma de imágenes FRET-FLIM basada en ARNm para cuantificar el escape endosómico de nanopartículas lipídicas y...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Biología celular
• Entrega de drogas

Sus antecedentes:

• El escape endosómico eficiente y el daño a la membrana son críticos para la entrega de nanopartículas de ARNm-lípidos (LNP), sin embargo, cuantificar estos procesos es difícil.
• Los métodos actuales carecen de la resolución dinámica para rastrear la liberación de ARNm y la integridad endosómica simultáneamente en células vivas.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar una nueva plataforma, la imagen FRET de por vida para el seguimiento del ARNm-LNP (FLINT), para el monitoreo en tiempo real de la cinética de liberación del ARNm y el daño endosómico.
• Investigar el impacto de la composición de LNP y las interacciones endosomales en la eficiencia de la entrega de ARNm.

Principales métodos:

• Desarrolló FLINT, una plataforma de transferencia de energía de resonancia de Förster de microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FRET-FLIM) que utiliza fluoróforos enlazados con disulfuro en ARNm.
• Aprovechó la concentración diferencial de glutatión (GSH) entre el citosol y los endosomas para la amplificación de la señal activada por GSH (20-50 ×) para rastrear el ARNm citosólico.
• Se aplicó FLINT para analizar la liberación de ARNm y el daño endosómico de diferentes formulaciones de LNP en células vivas.

Principales resultados:

• FLINT rastreó con éxito la liberación de ARNm y la dinámica de daño endosómico en células vivas.
• Los LNP con lípidos favorables para el escape mostraron una rápida liberación de ARNm citosólico, mientras que los LNP optimizados para la absorción se acumularon en los endosomas.
• Se observó la afluencia de GSH durante el daño endosómico y la ruptura de la membrana correlacionada con la expresión de ARNm.
• Se demostró que la organización lipídica dentro de los LNP, junto con el daño endosómico, influye en la eficiencia de la entrega de ARNm.

Conclusiones:

• FLINT proporciona una herramienta poderosa para desacoplar la absorción, el escape y los factores estructurales que influyen en la eficiencia de la entrega de LNP.
• La plataforma permite estudios mecanicistas y optimización de LNP para una mejor entrega de ARNm in vitro e in vivo.
• FLINT revela ideas críticas sobre la interacción compleja entre los LNP, los endosomas y la entrega de ARNm citosólico.