Integración de TIRF basado en prisma con microscopía confocal: un enfoque económico para los experimentos smFRET

Área de la Ciencia:

• La biofísica
• Microscopía
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La microscopia de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) ofrece una observación en tiempo real de alta resolución de la dinámica molecular.
• El TIRF basado en prisma (p-TIRF) es adaptable para el estudio de complejos macromoleculares, vesículas e interacciones proteína-ADN.
• La microscopia TIRF proporciona información sobre los mecanismos celulares mediante el análisis de las interacciones moleculares a nivel de una sola molécula.

Objetivo del estudio:

• Presentar un protocolo detallado y rentable para la construcción de una configuración TIRF basada en prismas.
• Adaptar un microscopio confocal existente para imágenes TIRF utilizando una fuente de luz compartida.
• Proporcionar un tutorial para construir, ensamblar, alinear la configuración p-TIRF y preparar muestras para experimentos de transferencia de energía de resonancia por fluorescencia de una sola molécula (smFRET).

Principales métodos:

• Integración de un módulo TIRF basado en prisma con un microscopio confocal.
• Utilización de una fuente de luz compartida para las modalidades confocal y TIRF.
• Protocolo paso a paso para la construcción, la alineación y la preparación de muestras de p-TIRF para smFRET.

Principales resultados:

• Se construyó con éxito una configuración p-TIRF funcional y rentable e integrada con un microscopio confocal.
• Los protocolos detallados permiten a los laboratorios ampliar sus capacidades de imagen.
• La configuración es adecuada para experimentos avanzados de una sola molécula, incluido el smFRET.

Conclusiones:

• Este protocolo permite a los laboratorios con microscopios confocales existentes adoptar técnicas avanzadas de imágenes TIRF.
• La configuración rentable de p-TIRF facilita los estudios de una sola molécula de alta resolución de los procesos biológicos.
• La integración ofrece una plataforma versátil para investigar los mecanismos moleculares dentro de las células.