Microflow LC-MS/MS revela firmas de modificación post-traduccional específicas de la plataforma en capsidos de virus...

Área de la Ciencia:

• Caracterización del vector de la terapia génica
• Fabricación biofarmacéutica
• Proteómica y modificaciones posteriores a la traducción

Sus antecedentes:

• Los virus recombinantes adeno-asociados (rAAV) son vectores clave de la terapia génica, pero la comprensión de las modificaciones post-traducionales de la cápside (PTM) es limitada.
• Los PTM influyen de manera crítica en la potencia, inmunogenicidad y consistencia de fabricación del rAAV, sin embargo, su caracterización en diferentes plataformas de producción es incompleta.
• Se necesita un análisis exhaustivo de las PTM para optimizar la producción de rAAV y garantizar la eficacia terapéutica.

Objetivo del estudio:

• Analizar y comparar exhaustivamente las modificaciones post-traducionales (PTM) en los serotipos rAAV5 y rAAV9 clínicamente relevantes.
• Evaluar el impacto de las PTM en la potencia vectorial y la infectividad en las plataformas de producción de células de mamíferos (HEK293) e insectos (Sf9).
• Establecer perfiles PTM como atributos de calidad potenciales para el control de la consistencia del lote rAAV.

Principales métodos:

• Para el análisis PTM de los vectores rAAV se utilizó el microflujo LC-MS/MS junto con la disociación activada por electrones (EAD).
• Los vectores se produjeron en células HEK293 y Sf9 en condiciones de pureza y estabilidad térmica coincidentes.
• Se realizaron ensayos de potencia e infectividad in vitro en paralelo con la caracterización de la PTM.

Principales resultados:

• Los vectores rAAV derivados de Sf9 exhibieron una carga PTM un 14% más alta en comparación con los vectores derivados de HEK293.
• Los rAAV derivados de HEK293 mostraron una potencia 1,9 veces mayor y una proporción de partículas físicas e infecciosas (P:I) significativamente reducida.
• La fragmentación de EAD identificó la formación de isoaspartato relacionada con sitios específicos de desamidado, y se observó una baja variabilidad en el recuento de sitios de PTM en lotes de Sf9 rAAV9.

Conclusiones:

• Los paisajes PTM son distintos entre las plataformas de producción HEK293 y Sf9, lo que influye en la potencia y la infectividad del vector rAAV.
• Los PTM específicos, como la formación de isoaspartato inducida por desamidado, pueden afectar la estabilidad y el rendimiento del vector.
• El perfil PTM ofrece una vía prometedora para el control de calidad y el monitoreo de la consistencia del lote en la fabricación de la terapia génica rAAV.