La ingeniería de la proteasa del virus del grabado del tabaco hacia una plataforma para la escisión sin rastro...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• Ingeniería de enzimas

Sus antecedentes:

• Las etiquetas de proteínas son esenciales en la ingeniería bioquímica, pero requieren su eliminación para evitar impactar negativamente en las moléculas objetivo.
• La proteasa del virus del grabado del tabaco (TEVp) se utiliza comúnmente para la eliminación de etiquetas, pero su estricta selectividad P1' limita su aplicación para objetivos no canónicos.
• La escisión actual de TEVp deja un residuo N-terminal, lo que impide la recuperación de los péptidos nativos.

Objetivo del estudio:

• Diseñar una nueva variante de TEVp con una especificidad de sustrato mejorada y más amplia para la escisión de etiquetas de proteínas sin rastro.
• Para superar las limitaciones de TEVp nativo en la escisión de sustratos no canónicos y la recuperación de péptidos con N-terminales nativos.

Principales métodos:

• Se utilizó el análisis de la red gráfica para identificar las posiciones de aminoácidos distales que influyen en la actividad de TEVp.
• Se utilizó un enfoque de diseño de biblioteca inteligente para diseñar variantes de TEVp.
• Se creó la variante TEVp-C1 y se probó con Switchtag-Teriparatida y sustratos de péptidos fluorogénicos.
• Se realizaron estudios mecanicistas para comprender el impacto funcional de las mutaciones introducidas.

Principales resultados:

• La variante TEVp-C1 de ingeniería demostró una división significativamente mejorada para 15 de los 20 aminoácidos naturales en la posición P1'.
• TEVp-C1 mostró una mayor actividad frente a cinco residuos desfavorecidos en la posición P1'.
• El análisis mecanicista indicó que las mutaciones en TEVp-C1 facilitan la etapa de transferencia de protones durante la catálisis.
• La proteasa diseñada permite la escisión sin rastros, produciendo péptidos con N-terminales nativos.

Conclusiones:

• TEVp-C1 representa una plataforma de proteasa prometedora para lograr la escisión sin rastros en aplicaciones de ingeniería de proteínas.
• El estudio valida el uso de herramientas computacionales para predecir las interacciones alostéricas para diseñar la especificidad del sustrato enzimático.
• Este trabajo abre nuevas vías para personalizar la actividad enzimática a través de mutaciones dirigidas en sitios distales.