NitrOFF: Un biosensor fluorescente diseñado para iluminar el transporte de nitratos en las células vivas

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• Biología celular

Sus antecedentes:

• El nitrato juega un doble papel en la fisiología humana, actuando tanto como contaminante como como nutriente vinculado al óxido nítrico.
• La comprensión básica de la biología de los nitratos, en particular la absorción y el almacenamiento, es limitada.
• La obtención de imágenes en tiempo real de nitrato en células de mamíferos es un desafío debido a la falta de biosensores adecuados.

Objetivo del estudio:

• Diseñar un biosensor fluorescente genéticamente codificado para el monitoreo en tiempo real de nitrato en células de mamíferos.
• Caracterizar la respuesta del biosensor a la unión de nitratos y su mecanismo estructural subyacente.

Principales métodos:

• Diseño e ingeniería de un biosensor (NitrOFF) mediante la fusión de EGFP y el dominio de reconocimiento de nitrato de NreA.
• Utilizó la evolución dirigida en siete rondas, introduciendo 15 mutaciones para optimizar el biosensor.
• Determinación de las estructuras cristalinas de rayos X tanto de apo como de NitrOFF unido al nitrato.
• Se evaluó la utilidad de NitrOFF en el control de la absorción de nitratos en las células HEK293.

Principales resultados:

• Desarrolló NitrOFF, un biosensor que exhibe una respuesta intensiométrica de apagado con una K_d de aproximadamente 9 μM.
• La cristalografía de rayos X reveló un cambio conformacional significativo (68,4 °) al unirse al nitrato, impulsado por la formación de hélices de enlace.
• El reordenamiento estructural altera la fluorescencia del EGFP al desprenderse una hebra clave, apagando efectivamente la fluorescencia.
• Se ha demostrado la capacidad de NitrOFF para controlar la absorción exógena de nitratos en células renales embrionarias humanas.

Conclusiones:

• NitrOFF es un biosensor fluorescente muy eficaz para la cuantificación de los niveles intracelulares de nitrato.
• Los conocimientos estructurales proporcionan una base para la comprensión de la regulación alostérica inducida por nitrato en los biosensores.
• NitrOFF permite el monitoreo en tiempo real de la dinámica de los nitratos en las células de los mamíferos, avanzando en la investigación de la biología de los nitratos.