Imágenes espectral con un microscopio confocal comercial sin un detector espectral

Área de la Ciencia:

• La biofísica
• Microscopía
• Espectroscopia

Sus antecedentes:

• Las imágenes espectrales son cruciales para el análisis de las sondas fluorescentes y la identificación de especies.
• El modo de escaneo lambda tradicional en los microscopios confocales sufre de mala resolución temporal e ineficiencia de fotones, lo que limita el análisis de muestras en vivo.
• Hay necesidad de mejorar las técnicas de imagen espectral compatibles con los microscopios confocales estándar.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un nuevo método de obtención de imágenes espectrales utilizando la adquisición simultánea de 4 canales y el análisis de fases espectrales.
• Demostrar el rendimiento mejorado del método con respecto al modo de escaneo lambda en términos de resolución temporal y eficiencia fotónica.
• Mostrar la aplicación de este método para el análisis de sondas sensibles al medio ambiente, desmixado espectral e imágenes multicolores en muestras biológicas vivas.

Principales métodos:

• Implementación de un sistema de adquisición simultánea de imágenes de 4 canales en un microscopio de barrido láser confocal comercial.
• Aplicación del análisis espectral de fases a los datos de 4 canales obtenidos para la caracterización espectral.
• Utilizando tintes sensibles al medio ambiente (ACDAN, rojo del Nilo) y proteínas fluorescentes (mEmerald, EYFP) para la validación del método.
• Realización de imágenes espectrales y multicolores en células vivas y organoides.

Principales resultados:

• El método de fase espectral de 4 canales ofrece una eficiencia de fotones y una resolución temporal superiores en comparación con el modo de escaneo lambda.
• La técnica puede discernir cambios de emisión espectral tan pequeños como 5 nm entre compartimentos subcelulares.
• Se descompusieron con éxito las señales de Nile Red en dos componentes y se permitió la obtención de imágenes en tres colores en organoides vivos.
• Se ha demostrado la eficacia de la desmixura de espectros de emisión superpuestos de proteínas fluorescentes como mEmerald y EYFP.

Conclusiones:

• El análisis espectral de 4 canales es una técnica de imagen espectral viable y eficiente para microscopios confocales estándar.
• Este método avanza significativamente en el estudio de los sistemas biológicos vivos al permitir el análisis espectral de alta resolución y la obtención de imágenes multicolores.
• La técnica proporciona una herramienta poderosa para la desmixura espectral y la identificación de especies fluorescentes con espectros superpuestos.