Los sistemas CRISPR ortogonales para la integración dirigida y la edición de bases multiplex permiten la ingeniería...

Área de la Ciencia:

• Tecnologías de edición de genes
• Inmunoterapia celular
• Ingeniería genómica

Sus antecedentes:

• El desarrollo de terapias potentes de células T con receptor de antígeno quimérico alogénico (CAR) requiere modificaciones genómicas complejas.
• Los sistemas CRISPR/Cas convencionales conllevan riesgos de reordenamientos genómicos y genotoxicidad debido a rupturas de doble cadena (DSB).

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una estrategia de edición de genes múltiple más segura para la terapia de células T CAR utilizando la edición de bases sin DSB.
• Combinar la edición de bases para los nocauts genéticos con la integración transgénica dirigida para mejorar el desarrollo de células T CAR.

Principales métodos:

• Se utilizaron editores de base de S. aureus Cas9 (SaCas9) para el nocaut libre de DSB de B2M y REGNASE-1.
• Se emplean nucleasas de S. pyogenes Cas9 (SpCas9) para la integración dirigida del transgén CAR anti-CD19 en el locus TRAC.
• Se realizó una edición múltiple de genes en células T humanas primarias utilizando plantillas de ssDNA no virales o de vectores virales (AAV6).

Principales resultados:

• Se han logrado altas frecuencias de edición de base para B2M (66%) y REGNASE-1 (84%).
• Integró con éxito el transgén CAR anti-CD19 en hasta el 71% de las células.
• Se demostró una reducción de 210 veces en las translocaciones cromosómicas equilibradas en comparación con los métodos tradicionales, sin efectos perjudiciales observados en la función de las células T CAR.

Conclusiones:

• Este enfoque ortogonal CRISPR/Cas ofrece una estrategia nueva y más segura para la ingeniería genética no viral y multiplexada de células T CAR.
• La edición de bases sin DSB reduce significativamente los riesgos genotóxicos asociados con el desarrollo de células T CAR.
• El método desarrollado aumenta el potencial para crear terapias alogénicas de células T CAR más seguras y efectivas.