Protocolo para la cuantificación de focos γH2AX en células irradiadas mediante inmunofluorescencia y software Fiji

Área de la Ciencia:

• Biología celular
• La genómica
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La cuantificación de las rupturas de doble cadena de ADN (DSB) es crucial para comprender el daño genómico y las respuestas de estrés celular.
• El marcador γH2AX es ampliamente utilizado para los DSB, pero los métodos de cuantificación actuales carecen de estandarización y reproducibilidad.
• El análisis manual o semi-cuantitativo introduce el sesgo del usuario y limita el rendimiento.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un flujo de trabajo estandarizado y automatizado para cuantificar focos γH2AX en células irradiadas.
• Mejorar la reproducibilidad y reducir el sesgo del usuario en la detección de ruptura de doble cadena de ADN.
• Crear un método de alto rendimiento adaptable tanto para focos nucleares como para estructuras similares a colonias.

Principales métodos:

• Desarrollo de una macro personalizada de Fiji para el conteo automatizado de focos γH2AX.
• Implementación de un protocolo estandarizado que incluye la irradiación celular, la tinción por inmunofluorescencia y la adquisición de imágenes.
• Adaptación del flujo de trabajo para formatos de placas con varios pozos, incluidos los ensayos clonogénicos.

Principales resultados:

• El macro automatizado de Fiji permite la cuantificación de alto rendimiento de focos de fluorescencia nuclear γH2AX con resolución de un solo núcleo.
• El flujo de trabajo estandarizado garantiza la reproducibilidad y la consistencia de las muestras cruzadas en la detección de ruptura de doble cadena de ADN.
• El protocolo es versátil, aplicable tanto a focos nucleares como a estructuras parecidas a colonias en varios formatos de ensayo.

Conclusiones:

• El flujo de trabajo automatizado presentado proporciona un método reproducible y estandarizado para cuantificar el daño al ADN.
• Este protocolo facilita el análisis de alto rendimiento de los focos γH2AX, minimizando el sesgo del usuario.
• La naturaleza adaptable del método lo hace adecuado para el uso de laboratorio de rutina en el daño del ADN y los ensayos clonogénicos.