Un método de inmunoafinidad-LC-MS basado en anticuerpos permitió una cuantificación ultra sensible y robusta de las...

Área de la Ciencia:

• Descubrimiento y validación de biomarcadores
• Química analítica
• Endocrinología y Metabolismo

Sus antecedentes:

• La medición precisa de las proteoformas de proinsulina en circulación es vital para la investigación de la diabetes mellitus.
• Los ensayos anteriores carecían de la especificidad y sensibilidad requeridas para la cuantificación precisa de múltiples proteoformas de proinsulina.
• Esta limitación impidió una comprensión completa de la función de las células beta y la progresión de la enfermedad.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un ensayo de espectrometría de masas por cromatografía líquida (LC-MS) altamente sensible y específico para cuantificar la proinsulina intacta y sus principales proteoformas (des-31,32 y des-64,65 proinsulina) y el péptido C en circulación.
• Aplicar por primera vez este nuevo ensayo para perfilar las proteoformas de la proinsulina en grupos clínicos, incluida la diabetes tipo 1 (DT1) de nueva aparición.
• Evaluar la utilidad de este ensayo para diferenciar los estados de enfermedad y comprender la dinámica de las células beta.

Principales métodos:

• Una estrategia de captura de afinidad cuantitativa utilizando un cóctel de anticuerpos optimizado para mitigar el sesgo entre proteoformas.
• La digestión de lisina-C (Lys-C) para generar péptidos de firma únicos para cada proteoforma de proinsulina.
• Espectrometría de movilidad de iones asimétrica de campo/espectrometría de masa de voltaje cíclico diferencial (FAIMS/dCV-MS) para el análisis ultrasensible y selectivo con una relación señal-ruido mejorada.

Principales resultados:

• El ensayo desarrollado demostró una sensibilidad excepcional, con límites inferiores de cuantificación (LOQ) en suero tan bajos como 1,7 pg/ ml para la proinsulina intacta.
• El ensayo diferenció con éxito a los sujetos de control de los pacientes con DT1 de nueva aparición, una distinción que no se logró con un ELISA paralelo de proinsulina total.
• Se observaron diferentes proporciones de abundancia relativa de proteoformas de proinsulina en todos los grupos clínicos, lo que sugiere un procesamiento o secreción diferencial de las células beta.

Conclusiones:

• Este nuevo ensayo LC-MS es el primero capaz de cuantificar de manera sensible las principales proteoformas de proinsulina en circulación, superando las limitaciones analíticas anteriores.
• El ensayo proporciona información valiosa sobre la función de las células beta y la fisiopatología de la diabetes, particularmente la diabetes tipo 1.
• La estrategia desarrollada es ampliamente aplicable para la medición dirigida de proteoformas de otros biomarcadores críticos.