Establecimiento de un protocolo de cribado de alto rendimiento basado en isomerasa utilizando Geobacillus sp. La...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Ingeniería de enzimas
• Ingeniería de proteínas

Sus antecedentes:

• La evolución dirigida genera variantes de enzimas, pero requiere un cribado eficiente de alto rendimiento (HTS) para identificar funcionalidades mejoradas.
• La L-ramnosa isomerasa (L-RI) es crucial para la isomerización de la D-alulosa a la D-alosa, con una actividad detectable a través de ensayos colorimétricos.
• Los métodos de selección existentes pueden carecer de la eficiencia y precisión necesarias para las grandes bibliotecas de mutantes.

Objetivo del estudio:

• Establecer un protocolo de cribado de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) robusto y fiable para seleccionar variantes de L-ramnosa isomerasa (L-RI, por sus siglas en inglés) de alta actividad.
• Optimizar y validar un ensayo colorimétrico para cuantificar la actividad de L-RI basado en el agotamiento de D-alulosa.
• Adaptar el protocolo para un formato de placa de 96 pozos adecuado para el cribado a gran escala en la ingeniería de proteínas.

Principales métodos:

• Optimización de las condiciones de reacción en un formato de tubo único para medir con precisión el agotamiento de D-alulosa utilizando la reacción de Seliwanoff.
• Validación del ensayo de tubo único con cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para una cuantificación precisa.
• Adaptación del ensayo a un formato de placa de 96 pozos, incluidos los pasos para la recolección de células, la eliminación de supernatantes y la filtración para minimizar la interferencia.

Principales resultados:

• El protocolo optimizado cuantifica con precisión el agotamiento de la D-alulosa, mostrando una excelente concordancia con las mediciones de HPLC.
• El formato de la placa de 96 pozos demostró una alta calidad analítica con un factor Z' de 0,449, una ventana de señal (SW) de 5,288 y un coeficiente de variabilidad del ensayo (AVR) de 0,551.
• Estas métricas estadísticas cumplen los criterios de aceptación para un ensayo HTS de alta calidad.

Conclusiones:

• Se ha establecido con éxito un protocolo HTS fiable y eficiente para el cribado de la actividad de L-RI.
• Este protocolo es adecuado para identificar variantes de isomerasa de alta actividad en los esfuerzos de ingeniería de proteínas.
• El método HTS desarrollado tiene una amplia aplicabilidad en entornos industriales y de investigación para el descubrimiento y la optimización de enzimas.