Mejora de la detección mediada por CRISPR/Cas de ácidos nucleicos mediante el uso de informadores basados en PNIPAM

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Biología molecular
• Ciencias de los materiales

Sus antecedentes:

• Los informadores CRISPR/Cas convencionales (por ejemplo, FQ, MB) se enfrentan a problemas de sensibilidad y compatibilidad.
• Los polímeros termo-responsivos ofrecen potencial para nuevos diseños de reporteros en el diagnóstico molecular.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y evaluar nuevos reporteros basados en poli (N-isopropilacrilamida) térmicamente sensibles para los sistemas CRISPR/Cas.
• Diseñar estrategias de amplificación de enzimas duales para la detección de ARN ultra-sensible utilizando estos nuevos reporteros.

Principales métodos:

• Los reporteros basados en PNIPAM fueron sintetizados y caracterizados por sus propiedades de respuesta térmica.
• Se diseñaron tres estrategias de amplificación de doble enzima, integrando los reporteros de PNIPAM con las enzimas Cas (LbuCas13a, Cas12a) y la amplificación enzimática secundaria (HRP, ALP).
• El ARN del SARS-CoV-2 se utilizó como objetivo modelo para evaluar el límite de detección (LOD) y la aplicabilidad práctica a través de ensayos de recuperación con picos.

Principales resultados:

• Los reporteres de PNIPAM funcionan eficazmente en reacciones homogéneas por debajo de su temperatura de solución crítica inferior (LCST), preservando la actividad de la proteína Cas y acelerando la cinética.
• Las estrategias de amplificación de doble enzima desarrolladas lograron un LOD ultrabajo de aproximadamente 1 fM para el ARN del SARS-CoV-2.
• Esto representa una mejora de sensibilidad de 100 veces en comparación con los sistemas CRISPR/Cas13a tradicionales.

Conclusiones:

• Los nuevos informadores basados en PNIPAM ofrecen una mayor sensibilidad y compatibilidad para los sistemas CRISPR/Cas.
• Las propiedades de separación térmica de los reporteros PNIPAM facilitan la integración con la amplificación aguas abajo, avanzando en el diagnóstico molecular.
• Estos hallazgos allanan el camino para la próxima generación de herramientas de diagnóstico basadas en CRISPR/Cas con un rendimiento superior.