Un ensayo de acetilación in vitro basado en CPM fluorescente: una herramienta para evaluar la actividad de la...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• Enzimología

Sus antecedentes:

• La acetilación N-terminal es una modificación co-traduccional crucial en eucariotas, que afecta aproximadamente al 80% de las proteínas citosólicas humanas.
• Esta modificación, catalizada por las acetiltransferasas N-terminales (NAT), regula las funciones vitales de las proteínas, incluida la estabilidad, la localización y las interacciones.
• Los métodos no radiactivos de alto rendimiento existentes para estudiar la actividad de las NAT son limitados, lo que dificulta una investigación exhaustiva.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y optimizar un ensayo novedoso, sensible y de alto rendimiento basado en fluorescencia para el monitoreo de la actividad de la N-terminal acetiltransferasa (NAT).
• Establecer un flujo de trabajo robusto para utilizar este ensayo con enzimas NAT humanas (NatA y NatB) para mediciones cinéticas y detección de inhibidores.
• Validar el rendimiento del ensayo en varios formatos de pozo y analizar posibles interferencias y estrategias de validación.

Principales métodos:

• Se optimizó un ensayo basado en la fluorescencia utilizando 7-dietilamino-3- 4'- maleimidilfenil) -4-metilcumarina (CPM) para detectar la coenzima A libre liberada durante la transferencia de acetil.
• Se estableció un flujo de trabajo completo que abarca la purificación de enzimas, la configuración de la reacción y la lectura de ensayos en tiempo real para NatA y NatB humanos.
• El ensayo fue miniaturizado a formatos de 384 y 1536 pozos y validado utilizando un inhibidor de bisubstrato, con optimización de las concentraciones de enzima/substrato y análisis del curso del tiempo.

Principales resultados:

• El ensayo optimizado de CPM demostró una alta sensibilidad y una correlación lineal entre la fluorescencia de CPM y la coenzima A liberada.
• El ensayo permite mediciones cinéticas precisas y pruebas de inhibidores en un formato de 96 pozos, con una miniaturización exitosa a formatos de 384 y 1536 pozos.
• Se detallaron los parámetros de optimización y las posibles interferencias del ensayo, junto con recomendaciones para la validación ortogonal para garantizar la especificidad del inhibidor.

Conclusiones:

• El ensayo de fluorescencia desarrollado proporciona un método sensible, de alto rendimiento y no radiactivo para estudiar la actividad NAT.
• Este ensayo facilita el análisis cinético preciso y la detección de inhibidores de las enzimas NAT, apoyando los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
• Las directrices de flujo de trabajo y optimización establecidas ofrecen una herramienta valiosa para los investigadores que investigan la acetilación N-terminal.