Detección mejorada de ácido nucleico basado en una sola vasija Cas12a a través de la inserción de epítopos y el...

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• Biotecnología
• Tecnología de diagnóstico

Sus antecedentes:

• CRISPR-Cas12a es una herramienta poderosa para el diagnóstico de ácido nucleico.
• Los sistemas CRISPR-Cas12a actuales se enfrentan a desafíos en cuanto a sensibilidad y flujos de trabajo en varios pasos, lo que limita las aplicaciones de pruebas en el punto de atención (POCT, por sus siglas en inglés).

Objetivo del estudio:

• Introducir el sistema ECOT (Engineered Cas12a for One-pot Test), un nuevo enfoque que combina la ingeniería de proteínas y la detección de un solo bote.
• Mejorar la sensibilidad, la especificidad y la velocidad de los diagnósticos basados en CRISPR-Cas12a para mejorar el POCT.

Principales métodos:

• Las variantes LtCas12a y LbCas12a diseñadas mediante la introducción de inserciones de epítopos GCN4 para reducir la actividad de cis-clivado.
• Fragmento variable de cadena única incorporado-Rad51 (scFv-Rad51) para mejorar la actividad de división trans de Cas12a y la amplificación de la señal.
• Se evaluó el rendimiento del sistema ECOT-Lb en la detección de muestras de ADN del VPH de baja copia y se comparó con la PCR cuantitativa (qPCR).

Principales resultados:

• El sistema ECOT demostró una reducción de la actividad cis- clivado y una mejora de la actividad trans- clivado.
• El sistema ECOT-Lb logró una alta sensibilidad, detectando tan solo 3 copias de ADN del VPH en menos de 30 minutos.
• Las pruebas clínicas mostraron que el sistema ECOT-Lb superó al qPCR tradicional en la detección de ADN de HPV de baja copia.

Conclusiones:

• El sistema ECOT ofrece una estrategia de ingeniería de proteínas versátil y escalable para mejorar las herramientas de diagnóstico basadas en CRISPR.
• El sistema desarrollado es adecuado para la autoevaluación en el hogar y el diagnóstico clínico generalizado debido a su alta sensibilidad, especificidad y respuesta rápida.
• Este trabajo presenta una plataforma prometedora para la detección molecular rápida en diversas aplicaciones.