Descifrar los efectos mutacionales en la dinámica conformacional de la NO sintasa inducible a través de la...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología estructural
• Enzimología

Sus antecedentes:

• Las sintasas de óxido nítrico de mamíferos (NOS) son flavohemoproteínas cruciales para la biosíntesis de óxido nítrico.
• Su actividad depende de las interacciones dinámicas interdominianas, particularmente el complejo FMN-hemo facilitado por la Calmodulina (CaM).
• Los estudios anteriores utilizaron la espectrometría de masas de enlace cruzado cuantitativa (qXL MS) para analizar la dinámica neuronal de NOS.

Objetivo del estudio:

• Investigar el impacto de la mutación E546N en la dinámica interdominio de la NOS inducible en humanos (iNOS) mediante el uso de qXL MS.
• Comparar las diferencias estructurales y dinámicas entre las construcciones de tipo salvaje (wt) y las construcciones mutantes de iNOS oxigenasa/FMN (oxyFMN) de E546N.
• Integrar los datos de qXL MS con el modelado computacional para un análisis exhaustivo de la dinámica de las proteínas inducidas por mutación.

Principales métodos:

• Espectrometría de masas de enlace transversal cuantitativa (qXL MS) con seguimiento paralelo de las reacciones.
• Modelado estructural y submuestreo de AlphaFold2.
• Modelado guiado por enlace cruzado AlphaLink2.

Principales resultados:

• La mutación E546N redujo significativamente los enlaces cruzados entre las subunidades FMN y los dominios hemo en iNOS.
• Los cambios inducidos por la mutación en los enlaces cruzados del dominio CaM-iNOS indicaron la propagación alostérica de las alteraciones estructurales.
• El modelado integrado y los datos de qXL MS revelaron conformaciones distintas para wt y E546N iNOS, con el mutante mostrando una mayor población de estados no acoplados.

Conclusiones:

• La mutación E546N interrumpe la dinámica funcional del complejo iNOS-CaM al alterar las interacciones FMN-hemo.
• Un enfoque integrado que combina el submuestreo qXL MS y AlphaFold2 proporciona un marco cuantitativo para mapear los cambios dinámicos inducidos por mutaciones en proteínas multidominio.
• Esta estrategia ofrece información sobre la regulación alostérica y las consecuencias funcionales de las mutaciones en enzimas complejas como iNOS.