Estructura cryo-EM del dominio de la ciclase y evaluación de la canalización del sustrato en una terpene sintasa de...

Área de la Ciencia:

• Bioquímica y Biología Molecular
• Biología estructural
• Biosíntesis de productos naturales

Sus antecedentes:

• Las copalidifosfatas (CPS) son enzimas clave en la biosíntesis de productos naturales relacionados con el labdano, que poseen una relevancia medicinal y ambiental significativa.
• Comprender las relaciones estructura-función de las diterpenas de clase II, particularmente las enzimas fúngicas, es crucial para explorar nuevos compuestos bioactivos.
• Los CPS bifuncionales, que poseen actividades tanto de preniltransferasa como de ciclase, no se han caracterizado estructuralmente, especialmente con respecto a la canalización del sustrato.

Objetivo del estudio:

• Determinar por microscopía criolectrónica de alta resolución (crio-EM) la estructura del dominio ciclasa de clase II de la copalil difosfato sintasa de Penicillium verruculosum (PvCPS).
• Investigar las relaciones estructura-función de los CPS fúngicos comparando el PvCPS con los ortólogos bacterianos y vegetales conocidos.
• Esclarecer el mecanismo de canalización de sustrato entre los dominios preniltransferasa y ciclasa dentro del PvCPS bifuncional.

Principales métodos:

• Purificación y determinación estructural de la crio-EM del dominio ciclasa de clase II de 63 kD de PvCPS con una resolución de 2,9 Å.
• Análisis estructural comparativo de PvCPS con enzimas homólogas de bacterias y plantas.
• Experimentos de competencia de sustrato para evaluar la interacción y la transferencia de sustrato entre los dominios preniltransferasa y ciclasa.

Principales resultados:

• La estructura cryo-EM revela residuos conservados críticos para la formación del núcleo de labdane cíclico, junto con residuos catalíticos divergentes involucrados en la etapa final de desprotonación en comparación con otros CPS.
• Las comparaciones estructurales destacan motivos conservados para la ciclización de diterpenos, pero también características únicas en la enzima fúngica.
• Los ensayos de competencia de sustrato demuestran una transferencia preferencial de difosfato de geranilgeranilo (GGPP) de la preniltransferasa al dominio de la ciclasa, incluso en construcciones separadas, que apoyan una canalización eficiente del sustrato.

Conclusiones:

• La caracterización estructural y funcional del dominio de la ciclasa PvCPS proporciona información sobre la evolución y el mecanismo de las diterpenas de clase II de hongos.
• Los hallazgos sugieren un modelo en el que la asociación transitoria entre los dominios preniltransferasa y ciclasa facilita la canalización del sustrato, optimizando la producción de difosfato de copalilo.
• Este estudio sienta las bases para los esfuerzos de ingeniería de proteínas para generar nuevos andamios de laboratorio con posibles aplicaciones terapéuticas.