Desarrollo y validación interlaboratorial de un material de referencia certificado de ADN de plásmido linealizado...

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Metrología
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La PCR digital (dPCR) es esencial para la cuantificación de la mutación genética y la variación del número de copias.
• El establecimiento de valores trazables SI para la calibración dPCR es un reto debido a la limitación de los materiales de referencia certificados (CRM).
• La falta de CRM dificulta la comparabilidad de los resultados de la dPCR.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y caracterizar un material de referencia de ADN de plásmido linearizado (RM) para la dPCR.
• Establecer los valores de concentración del número de copias rastreables por SI para la calibración de la dPCR.
• Evaluar la comparabilidad de los resultados de la dPCR utilizando el RM desarrollado.

Principales métodos:

• Desarrollo de un material de referencia de ADN de plásmido linearizado (RM).
• Caracterización mediante comparación entre laboratorios con la participación de tres institutos nacionales de medición (INM).
• Cuantificación ortogonal mediante el conteo de moléculas individuales y la dPCR independientes.
• Evaluaciones de homogeneidad y estabilidad.
• Dilución gravimétrica para crear un CRM secundario.
• Evaluación de cuatro plataformas de dPCR utilizando el CRM secundario.

Principales resultados:

• El RM desarrollado demostró homogeneidad y estabilidad.
• La comparación entre laboratorios mostró un fuerte acuerdo entre los IMN (En < 1).
• Se estableció la equivalencia de los resultados dentro de la incertidumbre ampliada.
• La evaluación secundaria del CRM reveló hasta un 10,5% de discrepancias entre las plataformas de dPCR.
• Se identificó la posibilidad de una sobreestimación significativa en la cuantificación del ácido nucleico.

Conclusiones:

• El material de referencia desarrollado proporciona valores SI rastreables para la calibración de la dPCR.
• Los CRM son esenciales para validar la cuantificación de la dPCR y garantizar la comparabilidad entre plataformas.
• Se necesitan CRM estandarizados para abordar las discrepancias en la cuantificación del ácido nucleico en los sistemas de dPCR.