Análisis continuo para la dNTP trifosfohidrolasa de SAMHD1 activado

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Enzimología
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• La proteína 1 (SAMHD1) estéril que contiene un motivo alfa y un dominio de histidina-aspartato es una hidrolasa trifosfórica humana.
• La actividad de la dNTPasa de SAMHD1 inhibe la síntesis de ADN, detiene el ciclo celular y restringe la replicación viral.
• La regulación alostérica compleja y la falta de señal espectroscópica directa desafían el análisis cinético de SAMHD1 y el descubrimiento de inhibidores.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un ensayo continuo para el control de la actividad de la fosfatasa SAMHD1 en su estado fisiológico activado.
• Para permitir un análisis cinético eficiente y el descubrimiento de inhibidores para SAMHD1.
• Para facilitar el cribado de alto rendimiento (HTS) de los inhibidores de SAMHD1.

Principales métodos:

• Un ensamblaje secuencial genera la forma tetramérica activa de SAMHD1.
• Dos fosfatasas convierten el trifosfato inorgánico (PPPi) en fosfato inorgánico (Pi).
• El Pi liberado se cuantifica utilizando la 7-metil-6-tioguanosina y la purina nucleósida fosforilasa para un ensayo espectrofotométrico continuo.

Principales resultados:

• Se estableció un ensayo espectrofotométrico sensible y continuo para la actividad de SAMHD1.
• El ensayo es adecuado para formatos de placas de 96 microondas para la medición continua de la actividad SAMHD1.
• El ensayo demostró un valor Z-prime > 0,90, lo que indica la idoneidad para HTS.

Conclusiones:

• El ensayo desarrollado monitorea efectivamente la actividad de la fosfatasa SAMHD1 en su estado activado.
• Este ensayo es una herramienta valiosa para el cribado de alto rendimiento de los inhibidores de SAMHD1.
• Ayuda a caracterizar la actividad alosterica o catalítica de los nuevos inhibidores de SAMHD1.