Habilitar la multiplexación de imágenes de fluorescencia de por vida utilizando UnaG a través de su modificación con...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Biología molecular
• Microscopía

Sus antecedentes:

• Las proteínas activadoras de fluorógeno son vitales para la microscopía y las imágenes funcionales, ofreciendo una alternativa independiente del oxígeno a las proteínas similares al GFP.
• Las limitaciones en la selectividad del fluoróforo y los canales espectrales dificultan el desarrollo de tintes sintéticos multicolores.
• La escasa permeabilidad celular de los tintes sintéticos restringe su aplicación en sistemas biológicos.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una paleta de sondas de proteína UnaG para microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM).
• Para superar las limitaciones de los tintes sintéticos mediante la utilización de bilirrubina como un cromóforo natural.
• Establecer las relaciones estructura-vida de los complejos UnaG-bilirrubina para aplicaciones in vivo.

Principales métodos:

• Diseño racional y ingeniería de la proteína UnaG.
• Utilizando la mutagenesis puntual y la incorporación de aminoácidos no canónicos.
• Utilizando espectroscopia de resolución de tiempo y microscopia de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM).

Principales resultados:

• Variantes UnaG generadas con una amplia gama de vidas de fluorescencia (de picosegundos a nanosegundos).
• Determinación de los límites de variación de la bilirrubina a lo largo de la vida basada en cambios estructurales de las proteínas.
• Se ha demostrado una distinción fiable de los cambios estructurales mínimos mediante el análisis de la vida celular.

Conclusiones:

• La proteína UnaG diseñada ofrece una plataforma versátil para las sondas FLIM multicolor.
• Las variantes UnaG basadas en bilirrubina superan las limitaciones de las proteínas fluorescentes tradicionales y los tintes sintéticos.
• Otras modificaciones pueden optimizar las características espectrales y temporales para la obtención de imágenes cuantitativas.