Una tubería enzimática y computacional integrada para cuantificar la edición de bases fuera del objetivo

Área de la Ciencia:

• Biología molecular
• La genética
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• La edición de bases de ADN ofrece una modificación genética precisa, pero carece de métodos robustos para detectar efectos fuera del objetivo.
• Para garantizar la seguridad de las tecnologías de edición de bases se requieren herramientas fiables para identificar alteraciones genómicas no intencionadas.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un flujo de trabajo generalizable e independiente del modelo para la identificación de sitios de edición de bases fuera del objetivo en todo el genoma.
• Establecer un método para el seguimiento de modificaciones involuntarias del ADN en células derivadas de pacientes para aplicaciones clínicas.

Principales métodos:

• Utilizó un derivado del editor de bases ABE8e con actividad de escisión de ADN de doble cadena (dsDNA) restaurada para marcar los sitios de escisión fuera del objetivo.
• Incorporación de oligonucleótidos de ADN en las rupturas de ADN generadas por enzimas, seguida de secuenciación de ADN para identificar ubicaciones fuera del objetivo.
• Se integró un ensayo celular (BEiGUIDE-Seq) con un flujo de trabajo computacional (CRISPRito) para crear paneles de amplicones optimizados para el monitoreo.

Principales resultados:

• El editor ABE8e identificó con éxito las localizaciones genómicas de la escisión fuera del objetivo.
• Cuantificó la extensión de la edición de la base en la proximidad de los sitios de escisión fuera del objetivo.
• Demostró la capacidad de detectar ediciones fuera del objetivo en células diana primarias, incluidas las derivadas de pacientes.

Conclusiones:

• Se introdujo BEiGUIDE-Seq, una nueva plataforma para detectar la edición de bases fuera del objetivo con alta precisión.
• Aborda una brecha crítica de seguridad en la edición de la base clínica al proporcionar un método para evaluar las ediciones no intencionadas.
• Se estableció una estrategia generalizable para evaluar la seguridad y la especificidad de las herramientas de edición de bases en contextos celulares relevantes.