Avanzar la actividad y la estabilidad de Luciferase más allá de la evolución dirigida y el diseño racional a través...

Área de la Ciencia:

• La bioquímica
• Ingeniería de proteínas
• Biología molecular

Sus antecedentes:

• Las luciferasas diseñadas son cruciales para las imágenes biológicas y la detección.
• La optimización de la luciferasa NanoLuc (NLuc) es difícil debido a las compensaciones de estabilidad y actividad y a la baja homología de secuencia.
• Los métodos existentes para la mejora de la NLuc son limitados.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar variantes mejoradas de NLuc con una mayor estabilidad térmica y actividad a temperaturas elevadas.
• Integrar el aprendizaje profundo computacional con el diseño racional guiado por la estructura para la ingeniería de enzimas.
• Establecer un marco de aplicación general para las enzimas de ingeniería con restricciones de estabilidad y actividad.

Principales métodos:

• Análisis sistemático de las bibliotecas de variantes de NLuc diseñadas.
• Integración del aprendizaje profundo computacional con el diseño racional guiado por la estructura.
• Simulaciones de dinámica molecular y estudios de plegamiento de proteínas.

Principales resultados:

• Se han desarrollado variantes de NLuc (B.07, B.09) con una mayor estabilidad térmica (aumento de 4,2 °C a una solubilidad del 50%).
• Se obtiene un aumento significativo de la actividad a temperaturas elevadas (320-370% del tipo silvestre a 55 °C).
• Se mantuvo la tolerancia al pH de NLuc y se mejoró la actividad con coelenterazina.

Conclusiones:

• Los terminales modificados y los bucles distales, al tiempo que preservan las redes alostéricas, mejoran la resistencia térmica.
• Las variantes NLuc desarrolladas ofrecen herramientas superiores para aplicaciones de bioluminiscencia.
• La metodología híbrida proporciona un marco versátil para la ingeniería de enzimas más allá de los enfoques tradicionales.