El perfilado conjunto de una sola célula de las ediciones y transcriptomas de Cas9 revela eventos extendidos fuera...

Área de la Ciencia:

• Genómica y Biología Molecular
• Tecnologías de edición de genes
• Análisis de una sola célula

Sus antecedentes:

• La ingeniería del genoma CRISPR-Cas9 se enfrenta a desafíos en la medición de los resultados de la edición y los impactos funcionales en la resolución de una sola célula.
• La evaluación precisa de las ediciones dentro y fuera del objetivo es fundamental para el avance de las aplicaciones de CRISPR-Cas9.

Objetivo del estudio:

• Introducir Superb-seq, una nueva tecnología para medir conjuntamente las ediciones de Cas9 dentro y fuera del objetivo y sus efectos de expresión génica a resolución de una sola célula.
• Caracterizar la prevalencia y el impacto de las ediciones fuera del objetivo de Cas9 en un experimento celular a gran escala.

Principales métodos:

• Superb-seq utiliza la transcripción in situ de T7 y la secuenciación de ARN de una sola célula.
• Aplicado a 10.000 células K562 dirigidas a cuatro genes remodeladores de cromatina con siete ARN guía.
• En conjunto, mide las ediciones de Cas9 y los cambios posteriores en la expresión génica.

Principales resultados:

• Superb-seq identificó 11.891 eventos de edición en 6.230 células en el sitio objetivo y 36 fuera del objetivo.
• Seis de las siete guías de alta especificidad indujeron ediciones detectables fuera del objetivo.
• Una sola edición fuera del objetivo en USP9X causó una interrupción generalizada de la expresión génica aguas abajo.

Conclusiones:

• La desorientación de Cas9 es generalizada, ocurre con frecuencia dentro de los intrones y puede tener efectos extensos en la expresión génica.
• Superb-seq es una tecnología versátil y accesible que permite las pantallas CRISPR de todo el genoma y la caracterización funcional de las guías de edición de genes.
• Esta tecnología supera las limitaciones anteriores en la evaluación de los resultados de edición de CRISPR-Cas9 y las consecuencias funcionales.