Circuitos CRISPR/Cas9 inducibles químicamente para perturbación génica de rango ultra alto

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular
• Tecnologías de Edición Génica
• Ingeniería Celular

Sus antecedentes:

• CRISPR/Cas9 es crucial para el modelado de enfermedades y los estudios de función génica.
• Los sistemas Tet-On existentes presentan expresión de Cas9 con fuga y actividad inducida débil.
• La fuga de Cas9 puede causar daño acumulativo al ADN y degradación del genoma.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar sistemas CRISPR/Cas9 inducibles avanzados con control mejorado.
• Superar las limitaciones de los sistemas existentes, como la fuga y la inducción débil.
• Mejorar el rango dinámico y la fiabilidad de la edición génica mediada por Cas9.

Principales métodos:

• Se diseñaron plataformas transgénicas que combinan la desestabilización e inhibición condicional de Cas9.
• Se desarrolló un sistema CRISPR inducible Tet todo en uno y ultrarrígido.
• Se creó un módulo de empalme de conmutación regulado por Branaplam para inducción alternativa.
• Se construyó un módulo de interferencia CRISPR (CRISPRi) dual y controlable, inducible por Tet.

Principales resultados:

• Se logró una funcionalidad Cas9 minimizada en el estado APAGADO y una eficiencia maximizada en el estado ENCENDIDO.
• Se demostró un rango dinámico excepcional (estado ENCENDIDO frente a estado APAGADO) en diversas líneas celulares y objetivos.
• Se validó un control robusto de la actividad de Cas9 con una línea base baja utilizando el sistema Branaplam.
• Se demostró un potente silenciamiento transcripcional con el módulo CRISPRi.

Conclusiones:

• El nuevo conjunto de sistemas CRISPR inducibles ofrece un control y una eficiencia superiores.
• Estas herramientas avanzadas tienen una amplia aplicabilidad en diversos tipos de células y entornos experimentales.
• Los sistemas desarrollados permiten un modelado de enfermedades y un análisis de la función génica más precisos.