Desarrollo de una D-aminoácido oxidasa termostable de alta funcionalidad para la biosíntesis eficiente de...

Área de la Ciencia:

• Biocatálisis; Ingeniería de Proteínas; Evolución Enzimática

Sus antecedentes:

• La D-aminoácido oxidasa (DAAO) es una enzima clave para la síntesis de aminoácidos quirales debido a su estereoselectividad.; La limitada termostabilidad de la DAAO dificulta su aplicación industrial y los esfuerzos de ingeniería de proteínas.

Objetivo del estudio:

• Ingenierizar una variante de DAAO con una eficiencia catalítica y termostabilidad mejoradas.; Ampliar el alcance del sustrato de DAAO para la síntesis de aminoácidos no naturales.

Principales métodos:

• Se empleó mutagénesis de saturación de codones múltiples guiada por ProteinMPNN para diseñar la DAAO.; Caracterización de la eficiencia catalítica, termostabilidad y alcance del sustrato de la variante de ingeniería.; Se utilizaron simulaciones de dinámica molecular (MD) para comprender la base estructural del rendimiento mejorado.

Principales resultados:

• La variante de DAAO de ingeniería (M5) demostró un aumento de 29 veces en la eficiencia catalítica hacia el D-glufosinato (D-PPT).; La variante exhibió una mejora de 208 veces en la termostabilidad, con una vida media de 519 minutos a 50 °C.; La DAAO de ingeniería transformó con éxito 500 mM de D-PPT en 7 horas a escala de 100 mL con alta estereoselectividad.

Conclusiones:

• La variante de DAAO de ingeniería muestra mejoras significativas en la eficiencia catalítica y la termostabilidad, lo que la hace adecuada para aplicaciones industriales.; El estudio proporciona información sobre las estrategias de ingeniería de enzimas para mejorar el rendimiento de la biocatálisis.; Este enfoque ofrece un método rentable para la evolución dirigida de enzimas para la biosíntesis de productos valiosos.