Un flujo de trabajo integrado para virología estructural con un microscopio electrónico de 100 keV | JoVE Visualize

Área de la Ciencia:

Biología estructural
Biofísica
Bioquímica

Sus antecedentes:

La criomicroscopía electrónica (cryo-EM) es crucial para estudiar muestras biológicas flexibles y heterogéneas.
Los microscopios cryo-EM de alta gama de 300 keV ofrecen datos de alta resolución, pero son caros y tienen un acceso limitado.
El acceso limitado a las instalaciones avanzadas de cryo-EM obstaculiza el progreso de la investigación y la capacitación.

Objetivo del estudio:

Presentar la operación exitosa gestionada por el usuario de una cryo-EM de 100 keV dentro de un laboratorio de biología estructural.
Detallar los aspectos prácticos de la instalación, el mantenimiento y la operación de un sistema de cryo-EM rentable.
Demostrar la viabilidad de la recolección y el procesamiento de datos de cryo-EM independientes y de alta calidad fuera de las instalaciones centrales.

Principales métodos:

Instalación y mantenimiento diario de un microscopio electrónico de 100 keV.
Flujo de trabajo integrado que abarca la selección de rejillas, la recolección de datos y el procesamiento de datos.
Se utilizó la cámara CMOS Ceta para reconstrucciones de baja resolución y el detector directo Falcon C para reconstrucciones de alta resolución.

Principales resultados:

Se demostraron reconstrucciones rutinarias de alta calidad de baja resolución y reconstrucciones de alta resolución adecuadas para la construcción de modelos atómicos.
Se exhibió un flujo de trabajo completo utilizando glicoproteínas de la superficie viral como estudios de caso.
Se logró competencia para principiantes en la operación independiente del microscopio dentro de un mes de uso regular y capacitación.

Conclusiones:

La cryo-EM de 100 keV gestionada por el usuario permite la investigación integrada en biología estructural, conectando la producción de proteínas con la determinación estructural.
Este modelo proporciona una plataforma de capacitación accesible, fomentando una experiencia más amplia en técnicas de cryo-EM.
Representa la primera demostración exitosa de un grupo de investigación moderno que gestiona de forma independiente las operaciones de cryo-EM y aprovecha sus capacidades para la biología estructural.