Un protocolo para el descubrimiento robusto de proteomas mediante cromatografía líquida nano utilizando tecnología de...

Área de la Ciencia:

• Proteómica
• Química Analítica
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• La cromatografía líquida nano-espectrometría de masas (LC-MS/MS) es crucial para la proteómica shotgun, ya que ofrece una alta potencia de separación y sensibilidad.
• El establecimiento de flujos de trabajo LC-MS/MS robustos y fiables para la proteómica a gran escala sigue siendo un desafío.

Objetivo del estudio:

• Proporcionar un protocolo detallado para el establecimiento de flujos de trabajo nano-LC-MS/MS para el perfilado profundo del proteoma completo y no dirigido.
• Optimizar un método de adquisición independiente de datos (DIA)-paralelo de acumulación-fragmentación en serie (PASEF) para proteómica de alto rendimiento.
• Demostrar la robustez y reproducibilidad del flujo de trabajo desarrollado.

Principales métodos:

• Se utilizó tecnología de columna de microarrays de pilares de segunda generación de última generación para una separación cromatográfica mejorada.
• Se desarrolló un flujo de trabajo sencillo para el análisis de adquisición independiente de datos (DIA)-paralelo de acumulación-fragmentación en serie (PASEF), incluida la optimización de la fuente ESI.
• Se exploraron gradientes segmentados y tensioactivos compatibles con MS para mejorar el rendimiento analítico.

Principales resultados:

• Se demostró una compensación entre el tiempo de análisis y la resolución cromatográfica que afecta la identificación de péptidos y proteínas.
• Se logró la identificación consistente de 7558 grupos de proteínas con alta repetibilidad (CV = 0.3%).
• Se mantuvo una alta reproducibilidad en los tiempos de retención de péptidos (CV medio = 0.2%) y la presión del sistema (CV = 0.4%) en 21 análisis.

Conclusiones:

• El flujo de trabajo nano-LC-MS/MS desarrollado proporciona un método robusto y reproducible para el perfilado profundo del proteoma.
• Este protocolo facilita estudios de proteómica fiables y a gran escala en ciencias de la vida.
• El método DIA-PASEF optimizado mejora el rendimiento y la calidad de los datos en los análisis proteómicos.