Depleción de ADN del huésped basada en DSN para la detección simultánea de patógenos de ADN y ARN en secuenciación de...

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular
• Genómica
• Diagnóstico Clínico

Sus antecedentes:

• La secuenciación de ácidos nucleicos es vital para la detección clínica de patógenos.
• El alto contenido de ADN del huésped en las muestras (90-99%) limita la sensibilidad de identificación microbiana en la secuenciación de próxima generación (NGS) metagenómica (mNGS).

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un novedoso método basado en nucleasa específica de dúplex (DSN) para reducir el contenido de ácido nucleico del huésped en la secuenciación clínica.
• Mejorar la sensibilidad de detección de patógenos tanto en NGS metagenómica (mNGS) como en NGS dirigida (tNGS).

Principales métodos:

• Se desarrolló un flujo de trabajo de nucleasa específica de dúplex (DSN) para degradar selectivamente el ADN del huésped.
• La optimización implicó probar la temperatura de anclaje, el ADN conductor (ADN Cot-1 y rProbe) y las concentraciones de cloruro de tetrametilamonio (TMAC).
• El método se validó utilizando comunidades microbianas simuladas y muestras clínicas.

Principales resultados:

• El método DSN aumentó las lecturas de patógenos por millón (RPM) de 2 a 3 veces en mNGS.
• Se observó una mejora más sustancial de 3 a 10 veces en las RPM de patógenos en NGS dirigida basada en cebadores (tNGS).
• Las condiciones óptimas incluyeron un anclaje de 65 °C, concentraciones específicas de ADN Cot-1 y rProbe, y 150 mmol·L-1 TMAC.

Conclusiones:

• El flujo de trabajo DSN ofrece un método rápido (<30 minutos) y de baja pérdida para el enriquecimiento microbiano en NGS clínica.
• Esta técnica mejora significativamente la sensibilidad de detección de patógenos al reducir la interferencia del ADN del huésped.
• Se pueden lograr mejoras adicionales en la eficiencia de la eliminación del huésped incorporando regiones repetitivas adicionales del genoma humano en el ADN conductor.