Ingeniería de sustratos de fusión GFP-NanoLuc para la detección cuantitativa sensible de la actividad de proteasas...

Área de la Ciencia:

• Bioquímica
• Biología Molecular
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• Las proteasas son cruciales en los procesos biológicos y las enfermedades, lo que las convierte en objetivos clave para diagnósticos y terapéuticos.
• Los ensayos de proteasas actuales a menudo utilizan sustratos caros derivados sintéticamente, lo que limita su accesibilidad y aumenta los costos.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un sustrato de proteasa basado en la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) codificado genéticamente.
• Crear una plataforma rentable y de aplicación general para la medición de la actividad de proteasas en tiempo real.

Principales métodos:

• Se construyó un sustrato basado en BRET utilizando NanoLuc (NLuc) y proteína fluorescente verde (GFP) fusionados por una secuencia de péptidos escindible.
• Se optimizó el sustrato con enlazadores de glicina-serina para mejorar la accesibilidad proteolítica.
• Se validó el sistema utilizando la proteasa del virus del mosaico del tabaco (TEV) y la caspasa-3.

Principales resultados:

• El sustrato BRET intacto emite luz verde; la escisión proteolítica interrumpe BRET, lo que reduce la fluorescencia verde.
• Se logró la detección cuantitativa de la proteasa TEV con un límite de 0.0426 μM.
• Se demostró la detección sensible de la caspasa-3 con un límite de 0.62 nM.

Conclusiones:

• El sustrato BRET codificado genéticamente desarrollado proporciona una alternativa rentable a los sustratos sintéticos.
• Esta plataforma permite la medición sensible de la actividad de proteasas en tiempo real utilizando sistemas de expresión estándar como Escherichia coli.
• Ofrece una herramienta versátil para la investigación de proteasas, el diagnóstico y el desarrollo terapéutico.