Diferenciación rápida de neuronas funcionales a partir de hiPSC con reducción de factores de crecimiento

Área de la Ciencia:

• Biología de células madre
• Neurociencia
• Biotecnología

Sus antecedentes:

• Las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) ofrecen una fuente prometedora para la generación de neuronas.
• Los protocolos existentes para la diferenciación neuronal a partir de hiPSC a menudo involucran reactivos costosos y procedimientos complejos.
• La accesibilidad limitada dificulta la adopción generalizada de neuronas derivadas de hiPSC en laboratorios de investigación sin experiencia especializada.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar un protocolo simplificado y rentable para la diferenciación neuronal rápida a partir de hiPSC.
• Generar neuronas corticales funcionales utilizando un sistema NGN2 inducible por tetraciclina en medios mínimos.
• Evaluar el impacto de la inhibición de Notch en la eficiencia de la neurogénesis y la maduración neuronal.

Principales métodos:

• Las células madre pluripotentes inducidas humanas (KOLF2.1J) se transfectaron establemente con un casete NGN2 inducible por tetraciclina (TET-on) utilizando el sistema PiggyBac.
• Las células se indujeron con doxiciclina en medio Essential 6, con o sin el inhibidor de Notch DAPT.
• La diferenciación neuronal se evaluó mediante inmunocitoquímica (ICC) y RT-PCR, con caracterización funcional utilizando grabaciones de multielectrodo (MEA).

Principales resultados:

• El tratamiento con DAPT mejoró significativamente la eficiencia de la conversión neuronal, reduciendo las células no neuronales y aumentando la expresión de TUJ1.
• Las neuronas generadas expresaron marcadores corticales y maduraron a neuronas glutamatérgicas funcionales con actividad de red espontánea al día 14 y disparo síncrono al día 35.
• Se logró la obtención de imágenes en vivo de la extensión de neuritas a través de la transfección secundaria de PiggyBac para el etiquetado de Td-Tomato.

Conclusiones:

• Un flujo de trabajo optimizado y libre de factores de crecimiento permite la generación eficiente de neuronas funcionales a partir de hiPSC derivadas de pacientes.
• Este protocolo reduce significativamente el costo y la complejidad de la diferenciación neuronal, mejorando la accesibilidad para laboratorios con experiencia limitada.
• El método proporciona una plataforma robusta para el estudio de enfermedades neurológicas y el desarrollo de terapias basadas en células.