Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un confocal de disco giratorio con reasignación de...

Área de la Ciencia:

• Imagenología Celular y Molecular
• Biofísica
• Técnicas de Microscopía

Sus antecedentes:

• La microscopía de localización de moléculas únicas (SMLM) ofrece resolución a nanoescala, pero generalmente se limita a la obtención de imágenes celulares cerca de la superficie.
• Los métodos de iluminación convencionales como TIRF e HILO restringen SMLM a regiones cercanas al cubreobjetos.
• Existe la necesidad de técnicas SMLM que puedan obtener imágenes de células enteras en tres dimensiones.

Objetivo del estudio:

• Presentar un protocolo para realizar SMLM de célula completa utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación de fotones ópticos (SDC-OPR).
• Permitir la obtención de imágenes de moléculas únicas de alta precisión en todo el volumen celular completo utilizando la acumulación de puntos de ADN para la obtención de imágenes en topografía a nanoescala (DNA-PAINT).
• Proporcionar un método accesible para SMLM profundo utilizando equipos confocales estándar sin óptica personalizada.

Principales métodos:

• Se utilizó un microscopio confocal de disco giratorio equipado con reasignación de fotones ópticos (SDC-OPR).
• Se empleó la acumulación de puntos de ADN para la obtención de imágenes en topografía a nanoescala (DNA-PAINT) con sondas conjugadas de ADN para el etiquetado intracelular.
• Se desarrolló una guía paso a paso para la configuración del microscopio, la optimización de los parámetros de adquisición para imágenes profundas y la preparación de muestras para imágenes multicolor.

Principales resultados:

• Se demostró con éxito SMLM de célula completa utilizando SDC-OPR y DNA-PAINT en microscopios confocales estándar.
• Se logró una imagen de molécula única de alta precisión en todo el volumen celular completo.
• Se proporcionaron consideraciones críticas para minimizar el fondo, optimizar la resolución y garantizar la calidad de la imagen en regiones celulares profundas.

Conclusiones:

• Este protocolo permite SMLM profundo de célula completa utilizando equipos de microscopía confocal fácilmente disponibles.
• El método SDC-OPR amplía significativamente el alcance de las preguntas biológicas abordables por SMLM más allá de las regiones cercanas a la membrana.
• Los investigadores ahora pueden explorar estructuras a nanoescala dentro de todo el volumen celular con alta precisión.