Biosensor de fosfatasa alcalina (CAD) mediado por CRISPR/Cas12a de modo dual

Área de la Ciencia:

• Biotecnología
• Diagnóstico Molecular
• Biosensores

Sus antecedentes:

• La fosfatasa alcalina (ALP) es un biomarcador vital para el diagnóstico de trastornos hepatobiliares, enfermedades óseas y el seguimiento de la progresión del cáncer.
• Los métodos de detección existentes para ALP a menudo carecen de la sensibilidad, simplicidad y adaptabilidad requeridas para entornos clínicos y con recursos limitados diversos.
• Existe una necesidad crítica de herramientas de diagnóstico avanzadas que proporcionen una detección de ALP ultrasensible y versátil.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un novedoso sistema de detección de ALP (CAD) mediado por CRISPR/Cas12a con una doble lectura de señal (inmunoensayo de fluorescencia y flujo lateral).
• Mejorar la sensibilidad, especificidad y simplicidad operativa para la detección de ALP en comparación con las metodologías existentes.
• Permitir tanto el análisis cuantitativo de alta precisión en entornos clínicos como la detección cualitativa rápida en entornos con recursos limitados.

Principales métodos:

• Se diseñó un sistema de amplificación isotérmica mediado por CRISPR/Cas12a, utilizando una sonda de ADN en horquilla (HPP) para el reconocimiento de ALP.
• Tras la unión de ALP, la polimerasa Klenow (exo-) inicia la elongación, activando la actividad de *trans*-corte de Cas12a para la amplificación de la señal.
• El sistema se adaptó tanto para la detección cuantitativa basada en fluorescencia como para el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA) para la detección cualitativa visual y sin instrumentos.

Principales resultados:

• La lectura de fluorescencia logró un límite de detección altamente sensible de 0,1 U L^-1 con un amplio rango lineal (0,1-10 U L^-1), superando los métodos convencionales en un orden de magnitud.
• El sistema demostró una especificidad excepcional contra posibles interferentes biológicos.
• La adaptación LFIA proporcionó una detección visual sin instrumentos y fácil de usar con un valor de corte de alrededor de 7 U L^-1, adecuada para aplicaciones de punto de atención.

Conclusiones:

• La estrategia de biosensores CAD de modo dual ofrece un avance significativo en la detección de ALP, combinando alta precisión con simplicidad operativa.
• Este enfoque aborda eficazmente las limitaciones de los métodos actuales de lectura única, proporcionando una herramienta versátil para diversas necesidades de diagnóstico.
• El sistema CAD tiene un potencial sustancial para el diagnóstico temprano de enfermedades, la monitorización de pacientes y las pruebas de punto de atención, especialmente en entornos con recursos limitados.