Desarrollo de tecnología de renaturalización in situ para la evolución dirigida de enzimas de eucariotas

Área de la Ciencia:

• Bioquímica
• Biología Molecular
• Ingeniería de Proteínas

Sus antecedentes:

• Las enzimas eucariotas a menudo se expresan como cuerpos de inclusión inactivos en E. coli, lo que dificulta la evolución dirigida.
• Los métodos tradicionales de renaturalización y cribado son ineficientes para bibliotecas grandes.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar una estrategia de cribado de alto rendimiento para la evolución dirigida de enzimas eucariotas expresadas como cuerpos de inclusión.
• Permitir la identificación rápida de mutantes de enzimas funcionales a través de la renaturalización in situ.

Principales métodos:

• Se estableció un flujo de trabajo optimizado que incluye cultivo en microplacas, inducción, lisis celular, desnaturalización in situ y renaturalización.
• Se utilizó análisis bioinformático para guiar la mutagénesis del dominio catalítico de la DNasa I humana, creando una biblioteca de 1.051 variantes.
• Se implementó un proceso de cribado directamente a partir de la expresión de proteínas insolubles.

Principales resultados:

• Se identificó un mutante de DNasa I humana (N78T, V90N) con un aumento de 4,1 veces en la actividad enzimática.
• Se logró una mejora del 40 % en la actividad en un mutante de benzonasa utilizando la misma estrategia.
• Se demostró la generalidad y eficiencia del enfoque de renaturalización in situ.

Conclusiones:

• La renaturalización in situ es una estrategia eficaz para la evolución dirigida de enzimas eucariotas producidas como cuerpos de inclusión.
• Este método mejora significativamente la eficiencia de la identificación de mutantes funcionales para dianas enzimáticas desafiantes.
• El flujo de trabajo desarrollado acelera la ingeniería de proteínas y la optimización de enzimas.