Protocolo para el descubrimiento y caracterización de sistemas Cas12 en miniatura

Área de la Ciencia:

• Biología Molecular
• Tecnologías de Edición Genética
• Bioinformática

Sus antecedentes:

• La entrega eficiente de nucleasas CRISPR a través de vectores de virus adenoasociados (AAV) está limitada por el gran tamaño de las nucleasas.
• Esta restricción de tamaño limita el espacio para elementos regulatorios y cargas útiles terapéuticas adicionales dentro de un solo vector AAV.
• Las nucleasas Cas12 en miniatura ofrecen una solución al reducir las restricciones de empaquetamiento y al mismo tiempo mantener la actividad de escisión del ADN guiada por ARN.

Objetivo del estudio:

• Desarrollar y validar un flujo de trabajo para identificar nucleasas Cas12 funcionales y compactas.
• Abordar el desafío de la capacidad de empaquetamiento limitada en los vectores AAV para la edición genómica terapéutica.
• Proporcionar una base para la ingeniería de nuevas nucleasas Cas12 para entornos con entrega limitada.

Principales métodos:

• Minería de secuencias a gran escala combinada con filtrado filogenético y estructural.
• Perfilado del motivo adyacente a protospacer (PAM) y ensayos de escisión de ADN in vitro.
• Interferencia del genoma bacteriano y ensayos de edición del genoma en células humanas para confirmar la actividad de la nucleasa.

Principales resultados:

• Se estableció un flujo de trabajo sistemático para identificar y caracterizar nucleasas Cas12 en miniatura.
• El protocolo destiló con éxito datos de secuencias extensas en un conjunto de variantes Cas12 funcionales y compactas.
• La actividad demostrada en ensayos con bacterias y células humanas confirma el potencial de estas nucleasas.

Conclusiones:

• El flujo de trabajo desarrollado identifica eficazmente nucleasas Cas12 en miniatura adecuadas para la entrega AAV.
• Estas nucleasas compactas alivian las limitaciones de empaquetamiento, mejorando el potencial de las aplicaciones de edición genómica in vivo.
• Las variantes Cas12 identificadas sirven como puntos de partida valiosos para una mayor ingeniería en terapia génica.